Аналитические рассуждения Альфредо Гарсиа – Арьета Учебный практикум: Подготовка оценщиков по БЭ, Киев, октябрь 2009 года Всемирная организация здравоохранения

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |2 | Существующие руководства Руководство МКГ для предприятий –Валидация аналитических методов: определения и терминология, июнь 1995 года –Валидация аналитических процедур: методология, ноябрь 1996 года Руководство FDA для предприятий –Валидация биоаналитического метода, май 2001 года Документ с изложением концепции EMEA объявил о будущем руководстве от Комитета по медицинским продуктам, предназначенным для человека (CHMP)

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |3 | Соответствие нормам GCP/GLP Клинические исследования необходимо осуществлять в условиях, соответствующих принципам Надлежащей клинической практики, и кроме этого также требуется, чтобы аналитические методы и условия обращения с данными по отбору проб соответствовали принципам Надлежащей лабораторной практики. По всем предыдущим исследованиям, не имеющим подтверждения соответствия вышеупомянутым принципам, оценщику придется полагаться на качество поданного отчета

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |4 | GCP/GLP От GCP/GLP требуется обеспечение: –Качества и Доверия Во-первых, Доверию отводится решающая роль –Утверждение продукта на основании всего лишь одного или нескольких исследований Во-вторых, валидация биоаналитического метода: –Разработка метода –Валидация до проведения исследований –Валидация во время проведения исследований

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |5 | Контрольный стандарт Анализ лекарственных средств и их метаболитов в биологической среде осуществляется с использованием образцов с введенными калибровочными (контрольными) стандартами и с использованием образцов контроля качества Чистота контрольного стандарта, использованного в подготовке образцов с введенными стандартами, может повлиять на исследовательские данные Следуя данной логике, любой аналитический контрольный стандарт удостоверенной подлинности и, имеющий известное происхождение и чистоту, следует применять для подготовки растворов известных концентраций

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |6 | Контрольный стандарт Каждый контрольный стандарт должен сопровождаться указанием источника и номером серии, датой истечения срока годности, сертификатами анализов (соответствия) когда есть, и/или любыми свидетельствами происхождения и чистоты, полученными у себя или от третьей стороны По возможности, контрольный стандарт должен совпадать с анализируемым образцом Когда нет такой возможности, то следует использовать какое- то установленное химическое образование (щелочь или кислота, соль или эфир в чистом основании) известной чистоты

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |7 | Контрольный стандарт Как правило, применяется три типа контрольных стандартов: –(1) сертифицированные контрольные стандарты (например, фармакопейные стандарты из Фармакопеи США); –(2) промышленные контрольные стандарты, полученные из надежного коммерческого источника; –(3) прочие материалы, чья чистота подтверждена документами, и которые были специально для этой цели синтезированы аналитической лабораторией либо каким-то другим некоммерческим учреждением

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |8 | РАЗРАБОТКА МЕТОДА Необходимо написать конкретное и подробное изложение биоаналитического метода Это можно сделать в виде протокола, плана исследований, отчета и/или СОПа Любой метод будет достоверным, пока он будет валидирован

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October |9 | ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА Процедуры, показывающие надежность и воспроизводимость метода для запланированного использования. Существующие типы: –Полная валидация: первый раз, новое лекарственное средство либо добавление метаболитов –Частичная валидация: любые изменения в методе валидации –Перекрестная валидация: сравнение методов

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | ВАЛИДАЦИЯ ДО ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ Основоположные параметры валидации Метод, используемый для установления лекарственных средств и/или метаболитов должен быть: Избирательным Чувствительным Достоверным Точным Стабильным

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Избирательность Избирательность – это способность аналитического метода вычленить анализируемое вещество из прочих компонентов образца, представив его в количественном выражении Что касается избирательности, то анализы пустых проб из соответствующей биологической среды (плазмы, мочи или любой другой среды) следует получать как минимум из шести источников Каждая пустая проба должна быть проверена на перекрестное взаимодействие, в то время как избирательность следует обеспечивать на нижнем пределе количественного определения

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Избирательность Потенциально перекрестно взаимодействующие вещества в биологической среде состоят из эндогенных компонентов этой же среды, метаболитов, продуктов распада, а в самом исследовании из сопутствующих медикаментов и всех прочих экзогенных ксенобиотиков Если задача метода – дать количественное выражение более чем одного анализируемого компонента, то тогда каждый анализируемый компонент придется проверить в анализах, чтобы гарантировать отсутствие перекрестного взаимодействия

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Резко выделяющиеся значения экспериментальных величин Указанные в отчете данные по валидации метода с установлением достоверности и точности должны учитывать все резко выделяющиеся значения экспериментальных величин Хотя при этом также можно указать все расчеты достоверности и точности, которые исключают значения, статистически подтвержденные как таковые, что резко отличаются

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Достоверность Достоверность аналитического метода описывает близость средних результатов анализа, полученных с помощью метода, истинному значению (концентрации) анализируемого компонента Достоверность определяется повторным анализом образцов, содержащих известный объем анализируемого компонента (образцы контроля качества) Достоверность измеряется с помощью минимум пяти определяющих замеров на концентрацию

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Достоверность Рекомендуется как минимум три концентрации в диапазоне ожидаемых концентраций Среднее значение не должно превышать 15% фактической величины за исключением значения на уровне нижнего количественного предела, где отклонение не должно выходить за рамки 20% Мерой достоверности как раз и выступит отклонение средней величины от истинного значения

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Точность Точность аналитического метода показывает близость отдельных замеров анализируемого компонента при повторном применении процедуры к множественным аликвотам цельного и однородного объема биологической среды Точность измеряется с использованием как минимум пяти определяющих замеров на концентрацию Рекомендуется получить как минимум три концентрации в диапазоне ожидаемых концентраций

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Точность Точность, которая устанавливается при каждом уровне концентрации, не должна превышать 15% коэффициента вариаций (КВ) за исключением значений нижнего количественного предела, где оно не должно превышать 20% КВ Далее точность подразделяется на внутрисерийную точность или воспроизводимость, которая оценивает точность во время одного анализа серии и точность либо вопроизводимость между сериями, которая измеряет точность со временем, для чего могут понадобиться разные аналитики, оборудование, реактивы и лаборатории

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Точность: на протяжении одного и нескольких дней

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Извлечение Извлечение анализируемого компонента в количественных определениях является показанием детектора, полученным из объема анализируемого компонента, добавленного в и извлеченного из биологической среды, сопоставленного с показанием детектора, полученного для истинной концентрации чистого подлинного стандарта Извлечение имеет отношение к эффективности экстракции аналитического метода в пределах вариабельности

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Извлечение Извлечение анализируемого компонента не должно быть 100%, однако степень извлечения анализируемого компонента и внутреннего стандарта должна быть последовательной, точной и воспроизводимой Эксперименты по извлечению должны проводиться путем сравнения аналитических результатов по извлеченным пробам при трех концентрациях (низкой, средней и высокой) с неэкстрагированными стандартами, представляющими 100% извлечение.

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная / Стандартная кривая Калибровочная (стандартная) кривая – это взаимоотношения между показаниями инструмента и известными концентрациями анализируемого компонента По каждому анализируемому компоненту в выборке необходимо готовить калибровочную кривую Для адекватного определения взаимоотношений между концентрацией и показаниями надо использовать достаточное количество стандартов. Калибровочную кривую следует готовить в той же самой биологической среде, что и пробы в планируемом исследовании путем введения в среду известных концентраций анализируемого компонента

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная / Стандартная кривая Количество стандартов, используемое при построении калибровочной кривой, послужит функцией ожидаемого диапазона аналитических значений и характера анализируемого вещества / показаний взаимоотношения Концентрации стандартов следует выбирать на основе ожидаемого диапазона концентраций Калибровочная кривая должна состоять из пустой пробы (выборка биосреды, обработанная без внутреннего стандарта), нулевого образца (выборка биосреды, обработанная с внутренним стандартом), и из шести – восьми не нулевых образцов, охватывающих ожидаемый диапазон с учетом нижнего количественного предела.

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Нижний количественный предел Самый нижний стандарт на калибровочной кривой необходимо принять в качестве количественного предела, если будут выполнены следующие условия: Показания анализируемого компонента на нижнем количественном пределе должны быть как минимум в 5 раз больше пустых показаний. Показания определяющих точек аналитического компонента должны поддаваться определению, должны быть дискретными и воспроизводимыми с точностью до 20% и достоверностью до %.

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная кривая / Стандартная кривая / Концентрация – Показания Следует использовать наипростейшую модель для адекватного описания взаимоотношений концентрация-показания Выбор взвешивания и использование комплексного регрессивного уравнения следует обосновать При разработке калибровочной кривой следует удовлетворить следующим условиям: –20% отклонения нижнего количественного предела (НКП) от условной концентрации –15% отклонения всех стандартов кроме (НКП) от условной концентрации

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная кривая / Стандартная кривая / Концентрация – Показания Как минимум четыре из шести не нулевых стандарта должны удовлетворить вышеуказанным критериям, включая НКП и калибровочный стандарт при наивысшей концентрации (ВКП) Исключение стандартов не должно менять используемую модель

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Воздействие среды В случае с процедурами на основе LC-MS-MS необходимо сделать соответствующие шаги для обеспечения отсутствия воздействия среды напротяжение применения метода, особенно если характер среды изменился и уже перестал быть таким, как во время валидации метода Там, где только возможно для целей валидации, необходимо использовать ту же самую биологическую среду, которую применяли и в заданных образцах Такие ткани с ограниченной доступностью, как например костный мозг, можно заменить физиологически соответствующими уполномоченными средами

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Разбавление образцов Способность разбавить отобранные образцы изначально выше верхнего предела стандартной кривой должна быть продемонстрирована параметрами достоверности и точности при валидации

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Стабильность Стабильность лекарственного средства в биологической жидкости есть функцией условий хранения, химических свойств лекарственного средства, самой среды и системы укупорки в емкость Стабильность анализируемого вещества в какой-то конкретной среде и в системе укупорки имеет отношение только к данной среде и к системе укупорки и не должна экстраполироваться ни на какие другие среды и системы укупорки в емкость Стабильность анализируемого вещества необходимо установить желательно до анализа отобранных проб

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Стабильность Процедуры стабильности должны дать оценку стабильности анализируемых компонентов во время отбора и обращения с пробами, после длительного (при замораживании при заданной температуре хранения) и краткосрочного (настольного и при комнатной температуре) хранения, а также после прохождения через циклы заморозки и оттаивания на стадиях выполнения анализов Условия, использованные при экспериментах со стабильностью, должны отображать те ситуации, с которыми скорей всего столкнуться во время фактического обращения с пробами и с анализами

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Стабильность Процедура также должна состоять из оценки стабильности анализируемого вещества в базовом растворе. Все установления стабильности должны использовать комплект образцов, подготовленных из свеже приготовленного базового раствора анализируемого вещества в соответствующей биологической среде, свободной от анализируемого вещества и от перекрестного воздействия Базовые растворы анализируемого вещества для оценки стабильности надо готовить в соответствующем растворителе при известных концентрациях

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | 1. Стабильность замораживания и оттаивания Стабильность анализируемого компонента следует устанавливать после трех циклов замораживания и оттаивания Как минимум по три аликвоты при каждой из низких и высоких концентраций надо положить на хранение при заданной температуре хранения в течение 24 часов, а оттаивать нужно без всякой помощи при комнатной температуре После полного оттаивания образцы следует повторно заморозить на часа при тех же условиях Повторять весь цикл оттаивания-заморозки следует еще дважды, а потом отдать на анализ на третьем цикле Если анализируемый компонент нестабилен при заданной температуре хранения, то образец для стабильности следует заморозить при -70ºC во время циклов заморозки и оттаивания

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | 2. Краткосрочная температурная стабильность По три аликвоты при каждой из низких и высоких концентраций необходимо оттаивать при комнатной температуре и далее держать при этой температуре на протяжение часов (основываясь на ожидаемой продолжительности нахождения образцов при комнатной температуре в заданном исследовании) и подвергать анализу

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | 3. Долгосрочная стабильность Время хранения при оценке долгосрочной стабильности должно превышать промежуток от даты первого забора проб и датой последнего анализа проб Долгосрочную стабильность необходимо устанавливать при хранении как минимум трех аликвот при каждой из низких и высоких концентраций в тех же самых условиях, что и исследовательские пробы

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | 3. Долгосрочная стабильность Объема отобранных образцов должно хватить для анализа на три разных случая Концентрации всех образцов стабильности следует сравнивать со средним значением всех величин, рассчитанных задним числом, по стандартам при соответствующих концентрациях, начиная от первого дня анализов на долгосрочную стабильность

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | 4. Стабильность базового раствора Стабильность базовых растворов лекарственного средства и внутреннего стандарта должна оцениваться при комнатной температуре на протяжение как минимум 6 часов Если же базовые растворы охлаждаются в холодильнике или замораживаются на протяжение какого-то периода времени, то эту стабильность необходимо задокументировать По прошествии желаемого времени хранения стабильность надо проверить путем сравнения показаний инструмента с показаниями свежеприготовленных растворов

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | 5. Стабильность после подготовки Необходимо установить стабильность обработанных образцов, с учетом времени пребывания в автодозаторе Стабильность лекарственного средства и внутреннего стандарта необходимо оценить на протяжение ожидаемого времени серии по объему серии в образцах валидации путем определения концентраций на основе изначальных калибровочных стандартов

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | ПРИМЕНЕНИЕ К РУТИННЫМ АНАЛИЗАМ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Количественные определения всех образцов анализируемого вещества в биосреде должны быть окончены в том временном промежутке, пока имеются в наличии данные стабильности Образцы можно подвергнуть анализу с помощью единственного определения без повторения либо воспроизведения анализов, если метод количественных определений имеет приемлемую вариабельность Там, где бывает тяжело достичь высокой точности и достоверности, можно проводить по два а то и по три анализа для лучшего расчета анализируемого компонента

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная кривая Калибровочная кривая должна вырабатываться по каждому анализируемому веществу для количественного определения образцов в каждом из анализов серии и должна использоваться для расчета концентрации анализируемого вещества в неизвестных образцах в серии Анализируемая серия может состоять из проб контроля качества, калибровочных стандартов, и либо из (1) всех обработанных образцов, подлежащих анализу в качестве одной серии либо же (2) просто серии, состоящей из обработанных неизвестных образцов одного или более добровольцев в исследовании QC

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная кривая Стандарты и образцы контроля качества можно готовить в том же базовом растворе, куда ввели измеренное количество вещества для анализа, при условии проверки стабильности и достоверности Можно использовать среду из единственного источника при условии проверки избирательности Образцы стандартной кривой, пустышки, КК и исследуемые пробы можно расположить так, как это необходимо внутри серии согласно своему решению. Следует придумать, как будет выглядеть расположение стандартов и образцов КК внутри серии с целью распознавания дрейфа в количественном определении во время анализа QC

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная кривая Калибровочная (стандартная) кривая должна охватывать ожидаемый неизвестный диапазон концентрации проб в дополнении к образцу-калибратору при НКП Не рекомендуется производить расчет концентрации в неизвестных образцах путем экстраполяции стандартных кривых ниже уровня НКП или же выше самого высокого стандарта Вместо этого, следует переопределить кривую либо же образцы с более высокой концентрацией следует разбавить и опять подвергнуть количественным определениям

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Калибровочная кривая Стандартная кривая на основе среды должна состоять из как минимум шести стандартных точек без учета пустышек (либо в единственном числе, либо воспроизведенных), чтобы охватить весь диапазон. Те же самые корректировка, взвешивание кривой и критерий адекватности, установленные во время валидации до исследований, должны использоваться для стандартной кривой в самом исследовании Изменения во взаимоотношении функции показаний между валидацией до исследования и валидацией рутинной серии укажут на потенциальные проблемы

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Критерии приемлемости по калибровочным стандартам Образцы калибровочного стандарта на основе среды: 75%, либо как минимум шесть стандартов, при расчете задним числом (с учетом ВКП) должны попадать в пределы ±15%, но это не касается НКП когда то должно быть ±20% от условного значения –Все значения, которые не попадают в эти пределы, можно не учитывать, при условии, что те не изменят установленную модель Критерии приемлемости по достоверности и точности следует предоставлять как для эксперимента на протяжении дня, так и для эксперимента внутри серии –Критерии приемлемости по валидации до исследования (15%)

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Мониторинг мер по контролю качества Желательно проанализировать все исследуемые образцы вещества за одну серию Сразу после валидации аналитического метода для рутинного использования, его достоверность и точность необходимо будет постоянно отслеживать для обеспечения его последующей удовлетворительной работы Для достижения этой цели необходимо подвергнуть анализу количество образцов КК, подготовленных отдельно, которые будут анализироваться с обработанными аналитическими образцами в промежутках времени, основываясь на общем количестве этих образцов

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Меры по контролю качества (КК) Образцы КК, продублированные в трех концентрациях (один близко к НКП (т.е. 3 x НКП), один в середине диапазона, еще один ближе к верхней отметке диапазона) необходимо включать в каждое количественное определение серии Количество образцов КК (кратных трем) будет зависеть от общего количества образцов в серии А результаты образцов КК дадут основу для принятия либо же отбраковки серии

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Критерии приемлемости по КК Как минимум 67% (по четыре из шести) отобранных образцов КК должны попасть в пределы 15% своего соответствующего условного значения Две из шести (33%) проб КК могут оказаться за пределами 15% своего соответствующего условного значения, однако такого не может быть с двумя в одной и той же концентрации Минимальное количество проб (кратных трем) должно как минимум составить 5% от числа неизвестных образцов или шести суммарных КК, в зависимости от того, где будет большее значение Данные из выбракованных серий не нужно документировать, но сам факт выбраковки серии и причину неудачи следует записать

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Повторный анализ отобранных образцов Необходимо четко обосновать и все указать в отчете Документация должна указывать –Результаты изначального и повторного анализа –Записанные результаты –Установление количественных определений серии –Причины повторного анализа –Заказчика повторного анализа и –Руководителя, разрешившего повторный анализ. Повторный анализ клинических либо до-клинических образцов должен выполняться только согласно установленному СОПу.

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Повторный анализ Либо СОП, либо руководство для повторного анализа, причины повтора и критерии приемлемости Среди причин повторного анализа могут быть: –Повтор анализа клинических или до-клинических образцов для госорганов, –Несоответствия в воспроизводимых анализах, –Образцы не попадают в диапазон количественных определений, –Ошибки при обработке образцов, –Подвело обуродование, –Плохая хроматография и –Несоответствия в данных фармакокинетики Повторные количественные исследования следует делать в трех экземплярах, если позволит объем проб

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Восстановление данных по образцам Следует разработать специальный СОП или руководство по восстановлению данных про отобранные образцы Этот СОП или руководство должно объяснять, зачем восстанавливать данные и как будет выполняться эта процедура Обоснование этого восстановления следует четко расписать и задокументировать В отчете же следует написать об изначальных и о восстановленных данных

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | ДОКУМЕНТАЦИЯ Документацию по успешному завершению исследований по валидации следует предоставлять в отчете по валидации количественных определений СОПы общего характера и на конкретную тематику вместе с надлежащим учетом выступают неотъемлемой частью отвалидированного аналитического метода Данные, полученные для установления биоаналитического метода и КК должны быть задокументированны и готовы к аудиту и инспекции данных

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Документация, которую надо подавать в Агентство Документация, предназначенная для агентства, должна состоять из: –(1) итоговой информации, –(2) разработки и установления метода, –(3) биоаналитических отчетов по применению любых методов к рутинным анализам образцов и –(4) всей прочей информации, имеющей отношение к разработке и установлению метода и/или к рутинному анализу образцов.

Training workshop: Training of BE assessors, Kiev, October | Благодарю за внимание!