Молекулярные маркеры опухолей в клинике – история, настоящее и будущее Елена Сергеевна Герштейн Лаборатория клинической биохимии НИИ КО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, Москва. Национальные дни лабораторной медицины России – октября 2011 г. Москва

Молекулярные (клеточные, тканевые, биологические) маркеры опухолей: Определяются непосредственно в опухолевой ткани или в субклеточных фракциях (цитозоль, мембраны и т.п.). Определяются непосредственно в опухолевой ткани или в субклеточных фракциях (цитозоль, мембраны и т.п.). Характеризуют биологические особенности опухоли: способность к пролиферации или метастазированию, гормональную и/или лекарственную чувствительность и др. Характеризуют биологические особенности опухоли: способность к пролиферации или метастазированию, гормональную и/или лекарственную чувствительность и др.

2. Предсказание эффективности и выбор адъювантного лечения, в.т.ч. оценка чувствительности к препаратам направленного действия Два этапа использования тканевых маркеров 1. Прогноз течения заболевания и формирование групп повышенного риска рецидивирования и/или метастазирования Благоприятный прогноз – наблюдение Неблагоприятный прогноз Больные распространенными стадиями

Основные условия включения маркера в схему обследования больного и использования результатов для выбора лечения (Hayes et al., 1996) : Использование маркера должно приводить к более благоприятным результатам лечения - увеличению безрецидивной или общей выживаемости и/или улучшению качества жизни и/или снижению стоимости лечения. Использование маркера должно приводить к более благоприятным результатам лечения - увеличению безрецидивной или общей выживаемости и/или улучшению качества жизни и/или снижению стоимости лечения. Эти преимущества должны иметь I уровень доказательности (ASCO) – доказательства получены либо в специальном большом рандомизированном проспективном исследовании, либо в результате мета-анализа большого числа относительно небольших проспективных исследований. Эти преимущества должны иметь I уровень доказательности (ASCO) – доказательства получены либо в специальном большом рандомизированном проспективном исследовании, либо в результате мета-анализа большого числа относительно небольших проспективных исследований. Необходимы стандартизованные воспроизводимые методы с четко обозначенными критериями, а также наличие внутренних и внешних программ контроля качества. Необходимы стандартизованные воспроизводимые методы с четко обозначенными критериями, а также наличие внутренних и внешних программ контроля качества.

Где и как определяют биологические маркеры? 1 = увеличение количества копий гена 2 = более высокий уровень транскрипции мРНК 3 = увеличение количества белка в/на клетке 4 = секреция белка или его фрагмента Изменение функциональной активности белка A = ДНК B = мРНК C = белок Нормальный уровень маркера Ядро Цитоплазма Клеточная мембрана C B A C Амплификация/гиперэкспрессия

Рецепторы стероидных гормонов – критерий чувствительности к эндокринной терапии

C Р + мРНК Белки C ДНК Схема действия стероидных гормонов на клетку

Основные методы определения рецепторов стероидных гормонов Метод ПреимуществаНедостатки Радио- лигандный Объективный количественный метод, легко поддающийся контролю и позволяющий оценить функциональную активность рецепторов Нельзя четко определить принадлежность рецепторов опухолевым клеткам. Необходимость использовать только свежезамороженные ткани. Иммуногистохи- мический (ИГХ) Можно четко определить принадлежность рецепторов именно опухолевым клеткам. Возможность работы с архивным материалом (блоки и стекла). Полуколичественный метод, не охваченный программами контроля качества. Не оценивает функциональную активность рецепторов.

Присутствие в первичной опухоли молочной железы рецепторов эстрогенов (РЭ) свидетельствует о ее потенциальной чувствительности к лечебным мероприятиям, направленным на удаление источника эстрогенов из организма или на противодействие их эффектам. Присутствие в первичной опухоли молочной железы рецепторов эстрогенов (РЭ) свидетельствует о ее потенциальной чувствительности к лечебным мероприятиям, направленным на удаление источника эстрогенов из организма или на противодействие их эффектам. Наличие рецепторов прогестерона (РП) не только является первым необходимым звеном реакции клетки на прогестины и определяет ее чувствительность к соответствующим препаратам, но может также свидетельствовать о функциональной активности РЭ. Наличие рецепторов прогестерона (РП) не только является первым необходимым звеном реакции клетки на прогестины и определяет ее чувствительность к соответствующим препаратам, но может также свидетельствовать о функциональной активности РЭ.

Клиническое значение определения рецепторов стероидных гормонов Эффективность эндокринной терапии распространенного рака молочной железы составляет около 10% при рецепторотрицательных опухолях, примерно 50% - при РЭ-положительных опухолях и 75% - при опухолях, содержащих РЭ и РП. Эффективность эндокринной терапии распространенного рака молочной железы составляет около 10% при рецепторотрицательных опухолях, примерно 50% - при РЭ-положительных опухолях и 75% - при опухолях, содержащих РЭ и РП. Наличие в первичной опухоли молочной железы РЭ и/или РП свидетельствует об относительно благоприятном прогнозе, хотя разница в выживаемости между группами больных с рецепторположительными и рецептор- отрицательными опухолями составляет, как правило, не более 10%. Наличие в первичной опухоли молочной железы РЭ и/или РП свидетельствует об относительно благоприятном прогнозе, хотя разница в выживаемости между группами больных с рецепторположительными и рецептор- отрицательными опухолями составляет, как правило, не более 10%. Подтверждено мета-анализом, включавшим больных операбельным раком молочной железы, участвовавших в 55 рандомизированных исследованиях Подтверждено мета-анализом, включавшим больных операбельным раком молочной железы, участвовавших в 55 рандомизированных исследованиях Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group. Lancet 1998

Факторы роста и их рецепторы – показатель способности опухоли к саморегулируемой пролиферации.

Общая схема продукции и действия факторов роста Клетка-продуцент Клетка-акцептор Фактор роста Аутокринное действие Паракринное действие

Взаимосвязь между статусом РЭФР и выживаемостью больных раком молочной железы Количество исследовательских групп, занимавшихся этой проблемой с 1984 г Количество исследовательских групп, занимавшихся этой проблемой с 1984 г Число прослеженных больных ; всего – около 6000 Число прослеженных больных ; всего – около 6000 Процент РЭФР-полжительных опухолей - 14% - 67% Процент РЭФР-полжительных опухолей - 14% - 67% Радиолигандный метод использован в 15 исследованиях; иммуногистохимический - в 8; иммуноферментный - в 2; гибридизационный - в 2. Радиолигандный метод использован в 15 исследованиях; иммуногистохимический - в 8; иммуноферментный - в 2; гибридизационный - в 2. Длительность наблюдения месяцев Длительность наблюдения месяцев Отрицательную корреляцию с безрецидивной выживаемостью обнаружили 15 групп. Отрицательную корреляцию с безрецидивной выживаемостью обнаружили 15 групп. Отрицательную корреляцию с общей выживаемостью - 6 из 11 групп. Отрицательную корреляцию с общей выживаемостью - 6 из 11 групп. Прогностическая значимость РЭФР подтверждена в 6 из 10 многофакторных исследований. Прогностическая значимость РЭФР подтверждена в 6 из 10 многофакторных исследований. В 3 исследованиях показано, что высокая экспрессия РЭФР свидетельствует о гормонорезистентности опухоли, независимо от статуса рецепторов стероидных гормонов В 3 исследованиях показано, что высокая экспрессия РЭФР свидетельствует о гормонорезистентности опухоли, независимо от статуса рецепторов стероидных гормонов

Использование результатов определения РЭФР и рецепторов стероидных гормонов при выборе метода послеоперационного лечения больных РМЖ N-N- РЭФР +, в особенности, РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП РЭФР +, в особенности, РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП Группа с неблагоприятным прогнозом, требующая тщательного наблюдения и, возможно, адъювантной терапии без гормонов РЭФР РП + РЭ + Прогностически благоприятная группа – без лечения при отсутствии клинических показаний N+N+ РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП Комплексное лечение без гормонального компонента РЭФР РП + РЭ +, а также все РП+ опухоли Лечение, включающее гормональный компонент

Р Р Y Y Cys P Трансмембранная спираль Киназный участок Аутофосфори- лируемый фрагмент РЕЦЕПТОР ЭФР Лиганд-связывающий домен Блокаторы связывания лиганда с рецептором; Конъюгаты факторов роста и токсинов Ингибиторы тирозинкиназы

Препараты, направленно действующие на рецепторы семейства с-erbB Препарат Рецептор- мишень Механизм действия Год Герцептин(трастузумаб) HER2 мАТ к проксимальному внеклеточному домену 1998 Иресса(гефитиниб) HER1 – РЭФР Специфический низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы 2003 Эрбитукс(цетуксимаб) HER1 – РЭФР мАТ к внеклеточному домену 2004 Тарцева(эрлотиниб) HER1 – РЭФР Специфический низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы 2005 Омнитарг(пертузумаб) HER2 мАТ - ингибитор димеризации (HDI ) 2005 Тайверб (lлапатиниб) HER1 – HER2 Двойной ТК инкибитор 2006 Вектибикс (панитумумаб) HER1 – РЭФР мАТ к лиганд-связывающему домену

HER2/neu (c-erbB-2) – мишень для специфической терапии

Что такое HER2/neu ? ( H uman E pidermal growth factor R eceptor 2 ) Представитель семейства трансмембранных тирозинкиназных рецепторов, продуктов онкогенов группы c-erbB, в которое входит РЭФР, - одной из важнейших систем передачи митогенного сигнала. Представитель семейства трансмембранных тирозинкиназных рецепторов, продуктов онкогенов группы c-erbB, в которое входит РЭФР, - одной из важнейших систем передачи митогенного сигнала. Уникальный рецептор-диспетчер, который, не имея собственного лиганда, образует наиболее функционально активные димеры с другими рецепторами своего семейства и усиливает их эффекты. Уникальный рецептор-диспетчер, который, не имея собственного лиганда, образует наиболее функционально активные димеры с другими рецепторами своего семейства и усиливает их эффекты.

Трансактивация рецепторов семейства с-erbB с участием безлигандного рецептора HER2/neu. Клеточная мембрана Связывание лиганда Активированный гетеродимер Y Y Y Y P P P P Пролиферация Миграция Опухолевый рост и метастазирование Выживание Передача сигнала Тирозинкиназный рецептор Киназный домен HER2

Методы определения HER2 Иммуногистохимический метод визуализации белка на опухолевых клетках – первичный скрининг: Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) для оценки амплификации гена при ИГХ 2+:

Прогностическое значение HER2/neu Прогностическая ценность исследования HER2/neu при раннем РМЖ неоднозначна, однако с 2005 г. этот маркер включен в число факторов, учитываемых в т.н. Сент-Галленском прогностическом индексе. Прогностическая ценность исследования HER2/neu при раннем РМЖ неоднозначна, однако с 2005 г. этот маркер включен в число факторов, учитываемых в т.н. Сент-Галленском прогностическом индексе. Есть данные о том, что опухоли с амплифицированным геном HER2/neu слабо реагируют на эндокринную терапию, но чувствительны к последующей химиотерапии. Есть данные о том, что опухоли с амплифицированным геном HER2/neu слабо реагируют на эндокринную терапию, но чувствительны к последующей химиотерапии. Показано, что больным с HER2/neu+ опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии с использованием антрациклинов. Показано, что больным с HER2/neu+ опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии с использованием антрациклинов.

Опухоль-ассоциированные протеазы как показатели метастатической и инвазивной активности

Рецептор про-uPA + Peц - Про-uPA uPA Плазмин Плазминоген Про-коллагеназа IV др. металлопротеазы Деградация базальной мембраны и внеклеточного матрикса PAI-2 PAI-1 tPA Peц Система активации плазминогена

Безрецидивная выживаемость больных раком молочной железы в зависимости от уровня uPA и PAI-1 в опухоли Foekens et al. (2000) исследовали опухоли 2780 больных. Срок наблюдения – до 10 лет. Риск возврата заболевания возрастает в 1,88 раза при высоком уровне uPA в опухоли (>1,21 нг/мг белка). Риск возврата заболевания возрастает в 2,74 при высоком уровне PAI-1 в опухоли (>45,28 нг/мг белка).

Доказательная база I уровня: Проспективное рандомизированное кооперированное исследование, включавшее около 600 больных ранними стадиями РМЖ (Janicke et al., 2001) Проспективное рандомизированное кооперированное исследование, включавшее около 600 больных ранними стадиями РМЖ (Janicke et al., 2001) Объединенный многофакторный анализ данных 18 исследовательских групп, включавший в целом 8377 больных (Look et al., 2002) Объединенный многофакторный анализ данных 18 исследовательских групп, включавший в целом 8377 больных (Look et al., 2002) Оба исследования показали, что высокие уровни uPA и PAI-1 являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза, более значимыми, чем размер, степень злокачественности и рецепторный статус опухоли и возраст пациенток. Оба исследования показали, что высокие уровни uPA и PAI-1 являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза, более значимыми, чем размер, степень злокачественности и рецепторный статус опухоли и возраст пациенток.

Для определения цитозольной концентрации uPA, tPA and PAI-1 использованы наборы для ИФА, разработанные Department of Experimental and Clinical Endocrinology, Academic Hospital St Radboud, University of Nijmegen, the Netherlands. Для определения цитозольной концентрации uPA, tPA and PAI-1 использованы наборы для ИФА, разработанные Department of Experimental and Clinical Endocrinology, Academic Hospital St Radboud, University of Nijmegen, the Netherlands. Обследовано 917 больных злокачественными и доброкачественными опухолями различных локализаций: 102 больных раком молочной железы, 40 больных раком и 82 больных доброкачественными заболеваниями яичников; 58 больных немелкоклеточным раком легкого; 81 больной раком толстой кишки; 97 больных раком желудка; 121 больная раком и 18 больных с гиперпластическими изменениями эндометрия; 44 больных раком пищевода, а также 65 больных опухолями и опухолеподобными поражениями костей различного гистологического строения, 44 больных меланомой и 19 – доброкачественными пигментными заболеваниями кожи, 44 больных раком и 102 пациента с аденомой и другими заболеваниями щитовидной железы. AGAG Ab-1 Ab-2 Ab-3 Аb-4 Пероксидаза хрена Пероксидаза хрена Ab - антитела AG = uPA, PAI-1 или tPA Ab - антитела AG = uPA, PAI-1 или tPA В лаборатории клинической биохимии РОНЦ Показано, что значительное и координированное увеличение содержания uPA и PAI-1 является практически универсальным свойством различных злокачественных опухолей. Соотношение экспрессии компонентов системы активации плазминогена с клинико- морфологическими особенностями и прогнозом заболевания зависит от типа опухоли.

Исследования лаборатории клинической биохимии РОНЦ РАМН: Количественными ИФА методами продемонстрировано значительное увеличение экспрессии представителей ключевых подсемейств ММП и ТИМП-1 в опухолях желудочно-кишечного тракта, у больных раком яичников и раком молочной железы. Для некоторых маркеров увеличение экспрессии и/или концентрации в периферической крови было положительно взаимосвязано со степенью местного распространения опухоли или с наличием отдаленных метастазов. В частности, перспективным сывороточным маркером для диагностики и мониторинга рака яичников оказалась ММП-7 (матрилизин): ее уровень повышен относительно контроля у 78% больных, он также коррелирует с ключевыми показателями распространенности рака яичников, а также с уровнем классического сывороточного маркера рака яичников – СА-125. Все это определяет перспективность дальнейших исследований роли ММП и ТИМП как биологических маркеров опухолей различных локализаций, характеризующих их инвазивный и метастатический потенциал.

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) – показатель активности неоангиогенеза.

Возможности антиангиогенной терапии (схема J. Folkman) Авастин

Прогностическое значение VEGF при раке молочной железы В 13 из 14 работ, опубликованных 8 независимыми группами исследователей, продемонстрировано, что высокая тканевая экспрессия VEGF является независимым фактором неблагоприятного прогноза РМЖ на ранних стадиях и/или его низкой чувствительности к традиционным видам гормоно- или химиотерапии при распространенном процессе. До настоящего времени не доказана возможность использования показателей содержания VEGF в крови (как в сыворотке, так и в плазме) в качестве адекватной замены тканевой экспрессии этого белка при оценке активности ангиогенеза в РМЖ и прогнозировании исхода заболевания.

Рекомендации Европейской группы исследования опухолевых маркеров по обследованию больных раком молочной железы: Определение рецепторов стероидных гормонов – РЭ и РП – у всех первичных больных для решения вопроса о целесообразности назначения эндокринной терапии. Оценка экспрессии (амплификации гена) HER2, если планируется лечение Герцептином. Определение PAI-1 и/или uPA для выявления группы с повышенным риском рецидивирования и метастазирования среди больных ранними стадиями (рассматривается). С 2005 г. рекомендовано также исследовать экспрессию (лучше – амплификацию) HER2/neu для формирования групп риска среди больных различными стадиями (Conference «Primary Therapy of Early Breast Cancer» St. Gallen, Switzerland, 2005).

Современные высокотехнологичные возможности исследования биологических маркеров

Использование технологии микрочипов (ДНК, РНК и белковых) позволяет одновременно исследовать амплификацию и/или экспрессию и/или транскрипцию многих тысяч генов и создавать т.н. «молекулярные портреты» или «генные подписи» опухолей. Использование технологии микрочипов (ДНК, РНК и белковых) позволяет одновременно исследовать амплификацию и/или экспрессию и/или транскрипцию многих тысяч генов и создавать т.н. «молекулярные портреты» или «генные подписи» опухолей. Дополнительным преимуществом таких исследований является высокая чувствительность, позволяющая работать с очень небольшим количеством материала. Дополнительным преимуществом таких исследований является высокая чувствительность, позволяющая работать с очень небольшим количеством материала. К недостаткам следует отнести высокую стоимость (пока), сложность стандартизации исследований и интерпретации результатов. К недостаткам следует отнести высокую стоимость (пока), сложность стандартизации исследований и интерпретации результатов.

Схема определения «генной подписи» РМЖ Sauter G, Simon R: Predictive molecular pathology. N Engl J Med 347: , 2002.

К настоящему времени разработано несколько систем классификации рака молочной железы на основе «генных подписей» - ограниченного набора генов, позволяющих выделять подгруппы больных с различным прогнозом и чувствительностью к отдельным видам терапии. К настоящему времени разработано несколько систем классификации рака молочной железы на основе «генных подписей» - ограниченного набора генов, позволяющих выделять подгруппы больных с различным прогнозом и чувствительностью к отдельным видам терапии. Наиболее известная система, базирующаяся на анaлизе экспрессии 70 генов - MammaPrint,, проходит клинические испытания по международной программе (EORTC - начало сентябрь 2006 г.) Microarray for Node Negative Disease May Avoid ChemoTherapy (MINDACT): В этом проспективном рандомизированном исследовании эффективность классификации с помощью «генной подписи» будет сопоставлена с эффективностью клинических критериев, основанных на программе Adjuvant! Online. Предполагается, что для получения достоверного результата в программу необходимо включить не менее 6000 больных. Наиболее известная система, базирующаяся на анaлизе экспрессии 70 генов - MammaPrint,, проходит клинические испытания по международной программе (EORTC - начало сентябрь 2006 г.) Microarray for Node Negative Disease May Avoid ChemoTherapy (MINDACT): В этом проспективном рандомизированном исследовании эффективность классификации с помощью «генной подписи» будет сопоставлена с эффективностью клинических критериев, основанных на программе Adjuvant! Online. Предполагается, что для получения достоверного результата в программу необходимо включить не менее 6000 больных. Другая достаточно стандартизованная система – подписьиз 21 гена - Oncotype DX, - проходит сейчас масштабные клинические испытания в рамках американской программы TAILORx (Trial Assigning IndividuaLized Options for Treatment /Rx/). В этом исследовании участвуют более женщин, проходящих лечение в 900 клиниках США и Канады. Другая достаточно стандартизованная система – подписьиз 21 гена - Oncotype DX, - проходит сейчас масштабные клинические испытания в рамках американской программы TAILORx (Trial Assigning IndividuaLized Options for Treatment /Rx/). В этом исследовании участвуют более женщин, проходящих лечение в 900 клиниках США и Канады.

Использование метода ПЦР в режиме реального времени: Мультиплексный ИФА уровня экспрессии белков в лизатах клеток и тканей:

Мутационный анализ значимых генов Моноклональные АТ к РЭФР : К препаратам чувствительны только больные колоректальным раком, опухоли которых имеют немутированный (wild-type) ген KRAS. Мутации в 12 и 13 кодонах экзона 2 этого гена, выявляемые у ~40% больных, приводят к утрате зависимости роста опухоли от РЭФР. Моноклональные АТ к РЭФР : К препаратам чувствительны только больные колоректальным раком, опухоли которых имеют немутированный (wild-type) ген KRAS. Мутации в 12 и 13 кодонах экзона 2 этого гена, выявляемые у ~40% больных, приводят к утрате зависимости роста опухоли от РЭФР. Низкомолекулярные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ РЭФР: Очень незначительная противоопухолевая активность по отношению к большинству опухолей с гиперэкспрессией РЭФР. К препаратам чувствительны только опухоли со специфическими мутациями в тирозинкиназном домене РЭФР (экзон 19 и/или 21), приводящими к его перманентной активации. Соответствующая мутация встречается достаточно редко - преимущественно у больных НМРЛ, никогда не куривших или бросивших курить. Низкомолекулярные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ РЭФР: Очень незначительная противоопухолевая активность по отношению к большинству опухолей с гиперэкспрессией РЭФР. К препаратам чувствительны только опухоли со специфическими мутациями в тирозинкиназном домене РЭФР (экзон 19 и/или 21), приводящими к его перманентной активации. Соответствующая мутация встречается достаточно редко - преимущественно у больных НМРЛ, никогда не куривших или бросивших курить.

Поиск новых информативных маркеров, характеризующих клинически значимые биологические особенности опухолей. Отбор оптимального набора дополняющих друг друга показателей, позволяющего при минимально возможной стоимости обследования обеспечить максимальную эффективность лечения каждого больного. Использование современных высокопроизводительных технологий (PCR-arrays, PhosphoELISArrays, микрочипы и др.) для комплексного исследования всего спектра маркеров, необходимых для решения конкретной клинической задачи. Перспективы