запрограммированная смерть микроорганизмов. Федор Северин НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ

клетка Неблагоприятные условия клетка Неблагоприятные условия клетка Альтруистическая смерть В окружении других клеток Оторванная от коллектива Истощение среды роста

PCD in autolysis of S. pneumoniae. Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi: /MMBR

Model of the fate of a bacterial population. Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi: /MMBR GASP – growth advantage at stationary phase

У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб Слизевики цАМФ Плодовое тело споры сытые голодные смерть Альтруистическая смерть 1)Истощение среды роста 2)Выяснение кто слабый 3)Слабые жертвуют себя в пользу сильных Высокая плотность клеток

«классический» апоптоз: Сигнал (повреждение ДНК, гормон….) Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного пространства цитохром с связывется с APAF APAF активирует каспазы

Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей 1.Образование АФК (активных форм кислорода) 2.Выход цитохрома с из митохондрий 3.Фрагментация ДНК на ранних этапах 4.Переход фосфатидилсерина из внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны 5.Чувствительность к ингибиторам синтеза белка 6.Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных : -метакаспаза -AIF Saccharomyces cerevisiae Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п. 5 мкм

Saccharomyces cerevisiae α альфа феромоны α Альфа-фактор α б Было известно: большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей. Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти

АФК Фаза Флоксин Б (мертвые клетки) Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой альфа-фактора -феромон +феромон мутант ste20 + феромон

Насколько физиологична 100-кратная доза феромона? Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящего слияние клеточных стенок без добавок + хлорохин Окраска флоксином Б Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромонов достигают смертельных значений

Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или нокаутом белка Ysp1 Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный лизис клеток, а активный каскад

Изучение механизма феромон-зависимой смерти: опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле. Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо Феромона использовали искусственный индуктор повышения концетрации кальция «пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК) «миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи «ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге «F» - FCCP, протонофор (разобщитель) Амиодарон, 80 мкМ Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти?

Дыхательная цепь АТФ-синтаза протечка H + H + FCCP почему снижение сопротивления мембраны может быть полезным?

Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett.FEBS Lett. 1997

Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий

Дыхательная цепь АТФ-синтаза протечка H + H + FCCP олигомицин Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном?

Концентрация кислорода Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны

Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS) FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает. Почему нокаут улучшает выживание?

10 мкм нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических срезов через клетку

5 мкм Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада - с помощью скринирования делеционной библиотеки Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий

почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти?

почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти? набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий

возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2 фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий? При этом площадь поверхности не изменяется, а максимальный суммарный объем уменьшается

Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining WT Δysp2 Normal mitochondria network Mosaic staining Depolarized mitochondria (dead cells) 1% 11% 88% 2% 35% 63% JC-1 staining of amiodarone treated cells

laser Laser hit experiments

ЛАЗЕР?? Wild-type cells Before laser After laser 5 min 10 min ysp2-delta cells A

Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте

феромон рецептор амиодарон ste20 подъем [Ca] в цитоплазме синтез белка циклогексимид подъем уровня сопряжения подъем Ψ АФК Ysp1, Ysp2-зависимая фрагментация митохондрий падение Ψ, выход цитохрома ц смерть клетки низкий FCCP миксотиазол NAC, токоферол ysp1, ysp2 митохондрия (2) (1) (3) (4) (1а) (5)(6) (7) (8) (9) (10) Модель каскада феромон-зависимой смерти

Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett.FEBS Lett как снизить мембранный потенциал «мягким» образом?

Б - использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации C12TPP SkQ1 Положительно-заряженные протонофоры (ионы класса SkQ)

Б Положительно-заряженные протонофоры (ионы класса SkQ) - использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации C12TPP SkQ1

Низкий pH в цитоплазме тормозит дыхательную цепь. Поэтому при закислении среды добавка FCCP не стимулирует потребление кислорода В отличии от FCCP, положительно- заряженный протонофор ускоряет дыхание даже при pH=3 в среде С12TPP – мягкий митохондриально- адресованный протонофор. Перспективное вещество для применения в медицине. Сейчас идут испытания на мышах C12-TPP Стимуляция дыхания

Иногда в ответ на ухудшение условий клетка вырабатывает количество АФК, достаточное для индукции анти-оксидантных систем и таким образом «готовится» к более сильным стрессам. Рассматривая популяцию дрожжевых клеток, логично ожидать, что относительно небольшой стресс будет индуцировать защитные АФК, а высокий уровень стресса (достаточный для массированного повреждения генома клетки) вызовет АФК-индукторы каскада смерти повреждающее и защитное действие АФК

метилметансульфонат (ММС) – метилирующий агент, повреждающий ДНК Ионол (анти-оксидант) Менадион (про-оксидант) контроль

Другие про-оксиданты действуют подобно менадиону

контр Окраска на АФК С12ТРР СTAB SDS C12TPP в высокой концентрации – мягкий про-оксидант Морфология митохондрий

Выживание, % ММС, мкМ без добавок С12-ТРРменадион актиномицин + менадион актиномицин + С12-ТРР ММС менадион Н2О2Н2О2 другие ответ на стресс катаболизм ДНК-связывающие А Б В Защитное действие про-оксидантов опосредовано их эффектом на экспрессию генов Синхронизованные клетки Ингибирование транскрипции убирает защитное действие про-оксидантов

Механизм токсичности агрегации белков, вызванной удлиненными полиглутаминами (полиQ). Экспрессия полиQ-CFP в дрожжах. CFP- синий цвет, иодид пропидия (мертвые клетки) – красный, FITC-VAD-fmk (детекция каспазной активности) – зеленый.

ко-локализация, % 103Q накапливается в ядре, делеция дрожжевого гомолога каспаз предотвращает это накопление. Следовательно, 103Q-зависимая смерть – активный процесс. Значит, можно пытаться прервать каскад нокаутом гена.

Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, % Дикий тип нокауты гипер- экспрессия Ase1 – субстрат циклосомы

циклины Cdk1 этапы фаза деления циклосома (APC-Cdc20 и APC-Cdh1) поли-убиквитинирование циклинов деградация циклинов в протеасоме переход в G0/G1 регуляция клеточного цикла

рабочая модель:

Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, % Дикий тип нокауты гипер- экспрессия

контроль 103QΔclb6 Δclb6, 103Q - накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.

контроль 103QΔclb6 Δclb6, 103Q - накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q. а какова ситуация при нейродегенеративных заболеваниях?