АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ Черновецкий М.А., заведующий лабораторией вирусологии и бактериологии ГУ РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии, кандидат медицинских наук, доцент

ИСТОРИЯ ВОПРОСА Открытие возбудителя (ВИЧ-1) – 1983 год Л.Монтанье; 1984 год – Р.Галло. В 1986 году появились сообщения об открытии варианта ВИЧ-2.

ОСНОВНЫЕ СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВИЧ Геномная РНК (две одноцепочечные молекулы) Нуклеопротеины p7, Vpr Латеральный белок Vpx (ВИЧ-2) Белок gp 41(ВИЧ-1) Белок gp36 (ВИЧ-2) Матриксный белок p17 Нуклеоидный белок p24 (ВИЧ-1) Комплекс ферментов (полимераза,обратная транскриптаза, интеграза, РНК-за Н) Мембранные белки клеточного происхождения

Основные диагностические маркеры ВИЧ-инфекции Специфические антитела (классов IgA,IgM и IgG) к поверхностным (envelope – gp41 и gp36) белкам вирусов, к нуклеоидному белку p24, к полимеразе (pol) Нуклеоидный белок p24 РНК ВИЧ 1 и РНК ВИЧ-2

Принцип определения и виды диагностических тест-систем Иммуноферментный – использование твердофазного микропланшета с целью выявлением специфических маркеров ВИЧ- инфекции с использованием ферментной метки (пероксидаза корня хрена - HRP) Радиоиммунный – использование микропробирок с целью выявления специфических маркеров ВИЧ-инфекции с использованием радиактивной метки (йод125) Хемолюминесцентный анализ – использование различных вариантов твердой фазы (планшет либо пробирка) с целью выявлением специфических маркеров ВИЧ-инфекции с использованием люминесцентной метки (изолюминол, акридин)

Основные варианты иммуноферментной диагностики Изолированное определение суммарных антител (класса IgM и IgG) к поверхностным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 Одновременное определение суммарных антител (класса IgM и IgG) к поверхностным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 а также антигена р24. (Перспективным направление является использование pol-белка)

Подтверждение специфичности обнаружения маркеров ВИЧ- инфекции Используется метод иммуноблоттинга – выявление спектра антител к различным антигенам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 за счет взаимодействия белков, нанесенных на диагностическую мембрану, со специфическими антителами в исследуемом биоматериале с последующей визуализацией антиген- антительного блока при помощи фермент-хромогенного комплекса.

Молекулярно-биологическая диагностика ВИЧ-инфекции Выявление консервативных участков генома ВИЧ-1 и ВИЧ-2 при помощи амплификационного анализа с использованием различных вариантов методов полимеразной (ПЦР) и лигазной цепной реакции (ЛЦР) в качественном и количественном варианте. Филогенетический анализ выявленных геномов ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Определение устойчивости к антитретровирусным препаратам, связанной с изменениями генома ВИЧ.

Основной нормативно-правовой документ Приказ Министерства здравоохранения 351 от 16 декабря 1998 года содержащий приложение 15 «Лабораторное обеспечение диагностики ВИЧ-инфекции»

Уровни лабораторной диагностики Лаборатории 1-го уровня (серологические) – проводят скрининговое обследование предусмотренных контингентов населения на наличие маркеров ВИЧ методом ИФА. Лаборатории 2-го уровня (арбитражные) – проводят скрининговые и арбитражные исследования первично-серопозитивных проб. Лаборатория 3-го уровня (референс- лаборатория) проводит скрининговые, арбитражные и подтверждающие исследования.

Алгоритм исследования проб на маркеры ВИЧ-инфекции Первичная серологическая апробация крови нам наличие маркеров ВИЧ- инфекции. Ретестирование одного и того же образца при первичном выявление маркеров ВИЧ-инфекции. Арбитражное исследование (в лабораториях 2-го и 3-го уровней) повторной пробы в случае подтверждения первично- положительного образца при вышеуказанном ретестировании.

Экспресс-метод серологического обследования Выявление специфических белков (антител и антигенов) помощи иммунохроматографического анализа с применением антител, меченных коллоидным золотом, либо окрашенных латекс-частиц. Время проведения анализа минут Время учета результатов - до 15 минут

Принцип метода иммуно- хроматографического анализа Взаимодействие определяемых специфических белков ( ВИЧ-антител) с меченными колоидным золотом (либо крашенными латекс-частицами) соответствующими протеинами (ВИЧ- антигенами), с последующей миграцией вдоль нитроцеллюлозной мембраны и образованием визуально детектируемых комплексов за счет контакта вышеобразованного блока «анти- ВИЧ+ВИЧ-антиген,меченный коллоидным золотом либо крашенными латекс- частицами» с нанесенными на мембрану специфическими ВИЧ-антигенами.

Вариант результата иммуно- хроматографического анализа Интактная диагностическая кассета Образец Контроль ВИЧ1 ВИЧ-2

Вариант результата иммуно- хроматографического анализа ВИЧ-отрицательная диагностическая кассета Образец Контроль ВИЧ1 ВИЧ-2

Вариант результата иммуно- хроматографического анализа ВИЧ-1положительная диагностическая кассета Образец Контроль ВИЧ1 ВИЧ-2

Вариант иммуно- хроматографического анализа ВИЧ-2 положительная диагностическая кассета Образец Контроль ВИЧ1 ВИЧ-2

Вариант иммуно- хроматографического анализа ВИЧ- и ВИЧ-2 положительная диагностическая кассета Образец Контроль ВИЧ1 ВИЧ-2

Вариант иммуно- хроматографического анализа Недействительная диагностическая кассета Образец Контроль ВИЧ1 ВИЧ-2

Вариант иммуно- хроматографического анализа Недействительная диагностическая кассета Образец Контроль ВИЧ1 ВИЧ-2

Схема иммуно- хроматографического анализа (HIV ½ 3.0 SD )

Документы, регламентирующие использование экспресс-тестов для диагностики ВИЧ-инфекции в РБ Приказ МЗ РБ 1008 от года «Об утверждении клинического протокола профилактики ВИЧ-инфекции от матери к ребенку» - разрешено использование экспресс-тестов на маркеры ВИЧ-инфекции для обследования беременных женщин, поступивших на роды с неизвестным ВИЧ-статусом.

Документы, регламентирующие использование экспресс-тестов для диагностики ВИЧ-инфекции в РБ Решение Странового координационного комитета по взаимодействию с Глобальным фондом для борьбы со СПИДом, туберкулезом и малярией 37 от года и 40 от года одобрено использование экспресс-тестов для диагностики ВИЧ- инфекции в рамках тестирования групп риска при проведении дозорного эпиднадзора.

ВОПРОС? Можно ли и нужно ли внедрять экспресс-тесты для диагностики ВИЧ-инфекции в рамках серологической апробации крови различных контингентов населения Республики Беларусь?

Результаты изучения целесообразности использования экспресс-тестов при определении наличия антител к ВИЧ 1/2 Проект международной технической помощи «Разработка Плана обеспечения устойчивости национальных ответных мер в отношении ВИЧ/СПИДа. Изучение целесообразности внедрения экспресс – диагностики ВИЧ в Беларуси среди определенных групп населения» Русанович А.В.

Рабочая группа (приказ МЗРБ от ) Черновецкий М.А.Главный внештатный специалист по лабораторной диагностике МЗРБ (председатель) Карпов И.А.Главный внештатный специалист МЗРБ по инфекционным болезням Барсуков А.Н.Главный акушер-гинеколог МЗРБ Коломиец Н.Д.Зав.кафедрой эпидемиологии и микробиологии ГУ «БелМАПО» Лукьяненко И.Г.Врач-вирусолог лаборатории вирусологии и бактериологии ГУ «РНПЦДОГиИ» Падуто Д.С.Заместитель главного врача УЗ «ГКИБ» г. Минска Русанович А.В.Врач-эпидемиолог отдела профилактики ВИЧ/СПИД ГУ «РЦГЭиОЗ» Сергеенко С.В.Врач-эпидемиолог отдела профилактики ВИЧ/СПИД ГУ «РЦГЭиОЗ» Фисенко Е.Г.Зав. эпидемиологичеким отделом ГУ «МГЦГиЭ»

Обязательные контингенты, подлежащие тестированию на наличие антител к ВИЧ доноры крови, органов и тканей Заключенные беременные женщины дети, рожденные ВИЧ-положительными матерями пациенты с ИППП потребители наркотиков пациенты по эпидемиологическим и клиническим показаниям, включая медицинский персонал лица при поступлении в образовательные учреждения Министерства обороны призывники Министерства внутренних дел и Министерства обороны иностранные граждане

Тестирование на наличие антител к ВИЧ 1/2 методом ИФА с использованием тест-систем ИФА рекомбинант HIV 1/2 производства СПОО «Фармленд», Республика Беларусь, и ДС- ИФА-анти-ВИЧ-унифицированный, производства МПО «Диагностические системы», Российская Федерация, экспресс – тесты на основе метода хроматографического анализа с использованием коллоидного золота для определения антител к ВИЧ1/2 в цельной крови - набор для экспресс-анализа ВИЧ (HIV) в крови HIV-1/HIV-2 AB тест производства «AUDIT DIAGNOSTICS – «Мульти-Тест», Беларусь,

Результаты исследований с 31 мая по 13 ноября 2012 года было протестировано 1900 человек. положительный результат – 93 случая в 3-х случаях при отрицательном результате ИФА экспресс-тесты показали положительный результат в 1 случае при положительном результате ИФА экспресс-тест показал отрицательный результат

Результаты тестирования на наличие антител к ВИЧ КодКонтингентЧисло обследов анных лиц Положительный результат (ИФА+экспресс- тест) Абс.% 100Граждане РБ998303,0±0,5% 101 Лица, имевшие контакты с больным СПИДом или серопозитивным 14321,4±11,0% 102Наркоманы661725,8±5,4% 109Беременные17317,6±9,2% 114Анонимно804405,0±0,8% Итого ,9±0,5%

Возраст ная категор ия Протес тирова но Положитель ный результат (ИФА+ Экспресс-тест) мужчиныженщины Про тестиро вано Положитель ный результат протест ирован о Положитель ный результат Абс.% % % ,0±0,613410,7±0,716021,3±0, ,6±0,722952,2±1,030293,0±1, ,4±0,925183,2±1, ,0±1, ,2±1, ,3±1, ,7±3, ,9±1,810165,9±2,36845,9±2, ,8±3,049510,2±4,34237,1±3,9 46 и старше ,3±3,16334,8±2,734720,6±6,9 Всего ,9±0, ,9±0, ,0±3,2

Выводы экспресс-тесты на ВИЧ на основе метода хроматографического анализа с использованием коллоидного золота по специфичности сопоставимы с ИФА; имеют примерно одинаковую стоимость; не требуют использования высокотехнологичного оборудования и труда высококвалифицированных сотрудников; позволяют получить результат исследования в течение минут. Могут применяться в любой группе населения, не зависимо от возраста и гендерной принадлежности. Использование экспресс-теста на ВИЧ для рутинного скрининга населения вместо первичного ИФА приведет к сокращению расходов на транспортировку образцов крови в лабораторию и снизит количество людей с незавершенной верификацией диагноза «ВИЧ-инфекция».

Экспресс-тесты на основе метода иммунохроматографического анализа с использованием коллоидного золота для определения антител к ВИЧ 1/2 могут быть использованы в случаях экстренных ситуаций по медицинским показаниям, когда необходимо неотложно знать ВИЧ-статус пациента; при проведении дозорного эпиднадзора среди групп риска; в наркологических диспансерах при обследовании наркопотребителей; при рутинном скрининге населения.

Положительный результат в экспресс-тесте на наличие антител к ВИЧ 1/2 для верификации диагноза следует подтвердить в ИФА и иммуноблоттинге, при этом результат в экспресс-тесте нужно учитывать как первично положительный анализ в ИФА. В рамках разработки и переработки нормативных правовых актов, регламентирующих работу по профилактике, лечению и диагностике ВИЧ-инфекции считаем целесообразным включение в них в качестве одного их методов определения маркеров ВИЧ-инфекции экспресс-тестов на основе использования метода иммунохроматографического анализа.

Результаты тестирования по крови и слюне Количество протестиро ванных Положител ьный результат в ИФА Положительны й результат в экспресс-тесте по слюне % Население100333,0±1,7 МСМ22114,5±4,4 ЖСБ95101,1±1,1 Всего21754