Генетические факторы и особенности диагностики при мужском бесплодии Таневский В.Э., Гоголевская И.К., Ширшова Л.С. Центр планирования семьи и репродукции, отделение ЭКО г. Москва

Факторы, негативно влияющие на сперматогенез: психогенные (тяжелая психическая травма, длительный стресс, синдром хронической усталости и т.д.) психогенные (тяжелая психическая травма, длительный стресс, синдром хронической усталости и т.д.) физические (электромагнитное излучение, UF-лучи, радиоактивное излучение, высокая температура) физические (электромагнитное излучение, UF-лучи, радиоактивное излучение, высокая температура) химические (тяжелые металлы, органические соединения, пестициды, лекарства и т.д.) химические (тяжелые металлы, органические соединения, пестициды, лекарства и т.д.) бытовые интоксикации (чрезмерное употребление спиртных напитков, курение, использование наркотических веществ) бытовые интоксикации (чрезмерное употребление спиртных напитков, курение, использование наркотических веществ) метеорологические (атмосферное давление, температура воздуха, относительная влажность, скорость ветра) метеорологические (атмосферное давление, температура воздуха, относительная влажность, скорость ветра)

Здоровый образ жизни – успех в зачатии

Заболевания, приводящие к снижению фертильности генетические нарушения генетические нарушения эндокринные изменения эндокринные изменения нервно-психические заболевания нервно-психические заболевания соматические болезни соматические болезни инфекции, передающиеся половым путем инфекции, передающиеся половым путем болезни половых органов болезни половых органов

Инстинкт размножения – способ передачи генотипических и фенотипических особенностей особи

Естественный отбор - эволюционный процесс, при котором малоприспособленные особи не оставляют потомства эволюционный процесс, при котором малоприспособленные особи не оставляют потомства Чарльз Дарвин естественный отбор

Обследование пар, готовящихся к ICSI (Meschede et al.,1998) 2%5,5%

Патоспермия – манифестация хромосомных аномалий. В общей популяции уровень хромосомных аномалий невелик и составляет 0,5-3,0%. В общей популяции уровень хромосомных аномалий невелик и составляет 0,5-3,0%. Среди пациентов с нарушением фертильности доля лиц с хромосомными аномалиями возрастает до 7-10%. Среди пациентов с нарушением фертильности доля лиц с хромосомными аномалиями возрастает до 7-10%. Распространенность хромосомных нарушений среди мужчин с азооспермией достигает 20%. Распространенность хромосомных нарушений среди мужчин с азооспермией достигает 20%.

Генетическое обследование Цито- генетические методики Молекулярно- генетические методики

Кариотипирование Числовые аномалии 47,XXY 47,XYY 45,X Структурные аномалии транслокацииинверсии

Синдром Клайнфельтера Распространенность в мужской популяции 0,2% Распространенность в мужской популяции 0,2% У 80% обнаруживается кариотип 47,XXY У 80% обнаруживается кариотип 47,XXY У 20% выявляются: У 20% выявляются: 46,XY/47,XXY; 46,XY/47,XXY; 48,XXXY; 48,XXXY; 48,XXYY 48,XXYY

Синдром Клайнфельтера кариотип 47,XXY мужчины 1975 г.р.

Кариотипирование мозаицизм 45,X/46XY, мужчина 1970 г.р.

Синдром де ля Шапеля (ХХ-синдром у мужчин) центромера ХY ПАО SRY ГТР МЕЙОЗ рекомбинированная Х ПАО SRY ГТР центромера ПАО – псевдоаутосомная область ГТР – «горячая точка» рекомбинации - специфические последовательности Х-хромосомы - специфические последовательности Y-хромосомы

Структурные аномалии аутосом встречаются примерно у 1-2% бесплодных мужчин Аутосомные аберрации: реципрокные транслокации реципрокные транслокации роберсоновские транслокации роберсоновские транслокации перицентрические инверсии перицентрические инверсии

Сбалансированная реципрокная транслокация 46,XY, t (13;15)(q14.3;q26.3)

Сбалансированная реципрокная транслокация 46,XY, t (1;8)(p33;q43)

Сбалансированная роберсоновская транслокация 45,XY, der (13;14)(q10;q10)

Сочетание реципрокной транслокации и перицентрической инверсии 46,XY, t (7;20)(q22;q13.3), inv 10 (p12;q22)

Структурные аномалии половых хромосом Интактность Y хромосомы – необходимое условие нормального строения и функционирования мужской половой системы Интактность Y хромосомы – необходимое условие нормального строения и функционирования мужской половой системы (Sue,1994) SRYp q q12 q11AZFb Схематичное изображение Y-хромосомы центромера AZFa AZFc

Делеции X хромосомы Любая крупная делеция у мужчин - летальна Любая крупная делеция у мужчин - летальна Xp22-синдром - потеря небольшого сегмента дистальной части короткого плеча (Xp22-pter) совместимая с жизнью Xp22-синдром - потеря небольшого сегмента дистальной части короткого плеча (Xp22-pter) совместимая с жизнью Клинические проявления: врожденный ихтиоз, врожденный ихтиоз, пятнистая хондродисплазия, пятнистая хондродисплазия, низкорослость, низкорослость, умственная отсталость, умственная отсталость, синдром Калманна (гипогонадотропный гипогонадизм + аносмия) синдром Калманна (гипогонадотропный гипогонадизм + аносмия)

Результаты работы цитогенетической лаборатории За последний год исследовано 78 образцов крови мужчин с патозооспермией За последний год исследовано 78 образцов крови мужчин с патозооспермией У 10 пациентов выявлены хромосомные аномалии (12,8%): У 10 пациентов выявлены хромосомные аномалии (12,8%): а) числовые – у 4 (5,1%) кариотип 47,XXY у 3, кариотип 47,XXY у 3, мозаицизм 45,X/46,ХY у 1; мозаицизм 45,X/46,ХY у 1; б) структурные – у 6 (7,7%) реципрокная транслокация у 3, реципрокная транслокация у 3, роберсоновская транслокация – у 1 роберсоновская транслокация – у 1 перицентрическая инверсия у 1, перицентрическая инверсия у 1, сочетание транслокации с инверсией – у 1 сочетание транслокации с инверсией – у 1

Показания к кариотипированию Азооспермия, тяжелая олигозооспермия (менее 5 млн./мл), устойчивая к терапии астенозооспермия, сочетанные формы патоспермии. Азооспермия, тяжелая олигозооспермия (менее 5 млн./мл), устойчивая к терапии астенозооспермия, сочетанные формы патоспермии. Наличие у пациента со сниженной фертильностью гипоплазии и/или дистопии яичек; указания в анамнезе на орхопексию по поводу крипторхизма и/или невынашивание беременности у супруги Наличие у пациента со сниженной фертильностью гипоплазии и/или дистопии яичек; указания в анамнезе на орхопексию по поводу крипторхизма и/или невынашивание беременности у супруги Обследование супружеской пары, планирующей ИКСИ Обследование супружеской пары, планирующей ИКСИ

Делеции в AZF локусе Y хромосомы Частота встречаемости при азооспермии 5-11% Частота встречаемости при азооспермии 5-11% У пациентов с олигозооспермией делеции выявляются в 2-8% случаев У пациентов с олигозооспермией делеции выявляются в 2-8% случаев Yq11.21 AZFb эухроматический отдел длинного плеча Y-хромосомы центромера AZFa AZFc Yq11.23 гетерохроматический отдел длинного плеча Y-хромосомы

Делеции в AZF локусе Y хромосомы Делеции локуса AZFc выявляются чаще делеций AZFa и AZFb. Делеции локуса AZFc выявляются чаще делеций AZFa и AZFb. Манифестация делеции – отклонения в спермограмме из-за нарушения сперматогенеза при сохраненной эндокринной функции яичек. Манифестация делеции – отклонения в спермограмме из-за нарушения сперматогенеза при сохраненной эндокринной функции яичек. Гистологическая картина варьирует от полного или очагового Сертоли-клеточного синдрома до блокады сперматогенеза. Гистологическая картина варьирует от полного или очагового Сертоли-клеточного синдрома до блокады сперматогенеза. Диагностика осуществляется с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (мПЦР), когда происходит амплификация и анализ определенных маркерных последовательностей ДНК длинного плеча Y- хромосомы. Диагностика осуществляется с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (мПЦР), когда происходит амплификация и анализ определенных маркерных последовательностей ДНК длинного плеча Y- хромосомы.

Схематичное изображение делетированных участков локуса AZF (Черных В.Б., 2002) SRYZFYsY86sY84sY615sY134sY127sY254sY Шифр карт пациентов del AZFa del AZFb+c норма del AZFc YpAZFaAZFbAZFc

Результаты мультицентрового исследования делеций AZF локуса Y-хромосомы Группа пациентов Количество пациентов Выявленные делеции Литературные данные (Foresta et al., 2001) 1. Азооспермия36112,2% (44)11,0% 2. Тяжелая олигозооспермия 2098,1% (17)8,2% Всего57010,7% (61)10,5% Контрольная группа (фертильные) 2000,0% (0)0,4%

Спектр выявленных микроделеций в AZF-регионе Y хромосомы (n=61)

Хромосомные аномалии Генетическое консультирование Пренатальная диагностика

Муковисцидоз (CF) Аутосомно-рецессивное заболевание, при котором поражаются клетки экзокринных желез Аутосомно-рецессивное заболевание, при котором поражаются клетки экзокринных желез Основная причина возникновения – мутации гена CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Основная причина возникновения – мутации гена CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Частота определения аллеля F508 у больных центрально-европейского происхождения составляет 70%. Частота определения аллеля F508 у больных центрально-европейского происхождения составляет 70%.

Муковисцидоз (CF) CFTR белок присутствует в высокой концентрации на апикальных мембранах клеток бронхов, слюнных желез, поджелудочной железы, желез кишечника, эпителиальных клетках семявыводящих путей. CFTR белок присутствует в высокой концентрации на апикальных мембранах клеток бронхов, слюнных желез, поджелудочной железы, желез кишечника, эпителиальных клетках семявыводящих путей. При мутации в CFTR гене нарушается транспорт ионов хлора через клеточные мембраны в результате - происходит выработка чрезмерно вязкого секрета, нарушающего дренаж из соответствующих органов. При мутации в CFTR гене нарушается транспорт ионов хлора через клеточные мембраны в результате - происходит выработка чрезмерно вязкого секрета, нарушающего дренаж из соответствующих органов.

Муковисцидоз (CF) У 97% мужчин с муковисцидозом находят обструктивную азооспермию (хотя 2-3% - фертильны). У 97% мужчин с муковисцидозом находят обструктивную азооспермию (хотя 2-3% - фертильны). Генитальный статус: мошоночная часть семявыносящего протока либо полностью отсутствует, либо редуцирована до лентовидной структуры; мошоночная часть семявыносящего протока либо полностью отсутствует, либо редуцирована до лентовидной структуры; тело и хвост придатков яичек чаще всего гипо- или аплазированы; тело и хвост придатков яичек чаще всего гипо- или аплазированы; головки придатков, не являющиеся производными вольфовых протоков, обычно сохранены и заметно расширены. головки придатков, не являющиеся производными вольфовых протоков, обычно сохранены и заметно расширены.

В случаях отсутствия в анамнезе семейного муковисцидоза и CF-мутаций при скрининге, вероятностный риск рождения ребенка с данным заболеванием у подобной супружеской пары составляет всего 0,5%. В случаях отсутствия в анамнезе семейного муковисцидоза и CF-мутаций при скрининге, вероятностный риск рождения ребенка с данным заболеванием у подобной супружеской пары составляет всего 0,5%. В случае выявления мутации CFTR, риск рождения больного ребенка может достигать 50%. В случае выявления мутации CFTR, риск рождения больного ребенка может достигать 50%. Для предотвращения рождения больных детей у данной категории пациентов необходимо выполнять преимплантационную диагностику. Для предотвращения рождения больных детей у данной категории пациентов необходимо выполнять преимплантационную диагностику. Муковисцидоз (CF)

Врожденное отсутствие семявыносящего протока (ВОСП) Этиология. Этиология. 1.Проявление - муковисцидоза. У 75-80% пациентов с двусторонним ВОСП выявляют мутации двух аллелей гена CFTR, находящихся в гомозиготном или компаунд- гетерозиготном состоянии, либо мутацию гена CFTR в сочетании с наличием аллельного варианта 5Т [Chillon et al.,1995; Wang et al., 2002]. У 75-80% пациентов с двусторонним ВОСП выявляют мутации двух аллелей гена CFTR, находящихся в гомозиготном или компаунд- гетерозиготном состоянии, либо мутацию гена CFTR в сочетании с наличием аллельного варианта 5Т [Chillon et al.,1995; Wang et al., 2002]. Аллель 5T обнаруживают у 45-60% пациентов с ВОСП. Аллель 5T обнаруживают у 45-60% пациентов с ВОСП. 2.«Изолированная» аномалия. В 10-20% случаев ВОСП не обусловлено мутациями гена CFTR и ассоциировано с пороками развития органов мочеполовой системы. В 10-20% случаев ВОСП не обусловлено мутациями гена CFTR и ассоциировано с пороками развития органов мочеполовой системы.

Сравнительная оценка объема эякулята и его рН (Eckardstein et al., 2000) Обследуемые группы: 1.Фертильные пациенты (n=42) 2.Больные с азооспермией без мутаций CFTR (n=33) 3.Больные с азооспермией с мутациями CFTR (n=26)

Диагностика муковисцидоза В России первоначально рутинный скрининг (выявление тяжелых мутаций) на муковисцидоз выполнялся: В России первоначально рутинный скрининг (выявление тяжелых мутаций) на муковисцидоз выполнялся: для пациентов, у которых в родословной были больные муковисцидозом или есть (были) дети, больные муковисцидозом; для пациентов, у которых в родословной были больные муковисцидозом или есть (были) дети, больные муковисцидозом; рекомендовался для доноров спермы (при оплодотворении спермой CF-негативных доноров, риск рождения больных детей снижается до 1:230000) рекомендовался для доноров спермы (при оплодотворении спермой CF-негативных доноров, риск рождения больных детей снижается до 1:230000)

Рекомендации HFFA 1. Если при проведении рутинного исследования у мужчины выявляется одна из CF мутаций – женщина также проверяется на основные CF мутации. 2. Если у мужчины CF мутации не выявлены, но диагностировано одно- или двустороннее ВОСП, а у женщины определена одна из CF мутаций, паре предлагается преимплантационная или пренатальная диагностика. 3. Если у мужчины олигозоо- или азооспермия, но при скрининговом исследовании не выявляются CF мутации, женщина в обязательном порядке проверяется на наличие мутаций в CFTR гене.

Спектр мутаций в CFTR-гене Мутация Частота n (%) Спермограмма Генитальный статус Литературные данные F508 5 (2,5%) 2 - азооспермия 2 - олигозооспермия 1 - астенозооспермия 1 - ВОСП 2 – гипоплазия 2 - норма 3,0-5,6% del 21 kb 2 (1,0%) * 2 - азооспермия 1 – ВОСП 1 - гипоплазия - N1303K 1 (0,5%) олигозооспермиянорма delT1 (0,5%) олигозооспермиянорма - R117H2 (1,0%) 2 - азооспермия2 - гипоплазия 1,0% 5T5T19 (9,3%) 6 - азооспермия, 13 - олигозооспермия 1 - ВОСП 8 - гипоплазия 10 – норма 5,0-11,9% Всего 30 мужчин из 203 человек (14,8%)10,0-17,0%

Генетическое обследование пациентов с азоо- или олигозооспермией позволяет: 1. Сократить сроки обследования и, следовательно, лечения. 2. Избежать ненужного дорогостоящего эмпирически назначаемого лечения. 3. Поставить этиологически корректный диагноз, а не констатировать имеющиеся симптомы. 4. При наличии хромосомных или генетических аномалий, благодаря ВРТ пара может забеременеть и родить здорового ребенка в случаях использования преимплантационной и пренатальной диагностики.

Благодарим за помощь в подготовке доклада и предоставленные материалы сотрудника МГНЦ РАМН В.Б. Черныха, сотрудника цитогенетической лаборатории ЦПСиР Е.Н. Лукаш, зав. отд. генетики ЦПСиР В.А. Гнетецкую.