Клеточные механизмы иммунного ответа

Главный комплекс гистосовместимости

HLA - human leucocyte antigens - антигены тканевой совместимости. (cиноним: MHC - major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости) Комплекс генов, расположенных на коротком плече 6 пары хромосом человека. Гены основных локусов имеют свое представительство на поверхности клетки в виде антигенов HLA

Выделяют два основных класса генов главного комплекса гистосовместимости: I класс включает гены локусов А, В, С; II класс - D-область (сублокусы DR, DP, DQ) Названия генов и антигенов HLA состоят из одной или нескольких букв и цифр, например A3, B45, DR15, DQ4. Буква обозначает ген, а цифра аллель этого гена. Гены HLA обладают высоким полиморфизмом. Классы HLA

HLA I класса – экспрессированы на всех ядросодержащих клетках человека. HLA I класса – экспрессированы на всех ядросодержащих клетках человека. Обеспечивают взаимодействие между любыми клетками HLA II класса – гены, отвечающие за реализацию и силу иммунного ответа. HLA II класса – гены, отвечающие за реализацию и силу иммунного ответа. Антигены HLA II класса представлены на АПК, В-лимфоцитах Классы HLA

MHC I класса MHC I класса Экспрессия на всех ядерных клетках Экспрессия на всех ядерных клетках Распознаются ТкР цитотоксических Т- лимфоцитов Распознаются ТкР цитотоксических Т- лимфоцитов CD8 – рецептор к MHC I CD8 – рецептор к MHC I Основные подклассы HLA-A, B, C Основные подклассы HLA-A, B, C Презентация вирусных и цитоплазматических антигенов Презентация вирусных и цитоплазматических антигенов

MHC II класса MHC II класса Экспрессия на некоторых клетках, в основном на антиген-презентирующих клетках Экспрессия на некоторых клетках, в основном на антиген-презентирующих клетках распознаются ТкР Т-хелперов распознаются ТкР Т-хелперов CD4 – рецептор к MHC II CD4 – рецептор к MHC II Основные подклассы HLA-DR, DP, DQ Основные подклассы HLA-DR, DP, DQ Презентация бактериальных антигенов Презентация бактериальных антигенов

Class I MHC Class II MHC Экспрессия молекул MHC I и MHC II Все ядерные клетки экспрессируют MHC I Клетки экспрессирующие MHC II, также экспрессируют и MHC I

Классы HLA

Функциональная активность Т- и В- лимфоцитов, киллерная активность NK, поглотительная активность фагоцитов, уровень Ig являются наследственными факторами и находятся в ассоциативной связи с HLA-антигенами.

Антигены I класса являются мембранными гликопротеинами, состоящими из двух частей: гликозилированной полипептидной тяжелой цепи с молекулярной массой и β2-микроглобулина с молекулярной массой Структура HLA I класса

NH 2 Alloantigenic sites CHO NH 2 COOH P α1 α2 α3 β2 OH Plasma membrane Disulfide bridge Papain cleavage Cytoplasm NH 2

Молекулы HLA II класса также являются гликопротеинами, но состоят из двух нековалентно соединенных цепей α и β с молекулярной массой и соответственно. Структура HLA II класса

Plasma membrane Cytoplasm CHO NH 2 COOH α1 α2β2 β1

Трансплантология Гены HLA связаны с предрасположенностью к определенным заболеваниям. Описано более 200 заболеваний с повышенной экспрессией того или иного антигена. Нормальное развитие плода обусловлено степенью антигенного различия родителей. Клиническая значимость HLA

Disease Frequency in RelativeRiskAllelesPatientsControl Ankylosing spondylitis B Reiter's disease (syndrome) B Acute anterior uveitis B Psoriasis vulgaris Cw Dermatitis herpetiformis DR Celiac Disease DR Insulin-dependent diabetes mellitus DR3/

Определение антигенов HLA Серологические методы. Серологические методы. Молекулярно-генетические методы. Молекулярно-генетические методы. Клеточные методы. Клеточные методы.

Определение антигенов HLA Серологические методы. Основной серологический метод типирования антигенов HLA лимфоцитотоксический тест. Основной серологический метод типирования антигенов HLA лимфоцитотоксический тест. 1) к сывороткам против разных антигенов HLA добавляют по 2000 исследуемых лимфоцитов; 2) после инкубации добавляют комплемент (его источником может служить кроличья сыворотка); 3) лимфоциты, несущие антиген, против которого направлена сыворотка, под действием комплемента разрушаются; 4) затем к лимфоцитам добавляют краситель, который окрашивает только живые клетки. Результат оценивают по относительному числу погибших лимфоцитов.

Лимфоцитотоксический тест

Недостатки серологических методов Для типирования антигенов класса I необходимо не менее 15 мл, а для типирования антигенов класса II не менее 30 мл крови. Для типирования антигенов класса I необходимо не менее 15 мл, а для типирования антигенов класса II не менее 30 мл крови. Жизнеспособность выделенных лимфоцитов должна составлять не менее 80%. Жизнеспособность выделенных лимфоцитов должна составлять не менее 80%. Загрязнение, длительное и неправильное хранение приводят к снижению качества сывороток и комплемента, используемых для исследования. Загрязнение, длительное и неправильное хранение приводят к снижению качества сывороток и комплемента, используемых для исследования. Получение диагностических сывороток трудоемкий и дорогостоящий процесс. Особенно трудно получить сыворотки к редким антигенам HLA. Наименее доступны сыворотки к антигенам HLA класса II, особенно к антигенам HLA-DP. Получение диагностических сывороток трудоемкий и дорогостоящий процесс. Особенно трудно получить сыворотки к редким антигенам HLA. Наименее доступны сыворотки к антигенам HLA класса II, особенно к антигенам HLA-DP.

Молекулярно-генетические методы Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Определение специфических олигонуклеотидных последовательностей. Определение специфических олигонуклеотидных последовательностей. ПЦР ПЦР

Клеточные методы Смешанная культура лимфоцитов. 1) смешивают исследуемые лимфоциты и лимфоциты с известным гаплотипом; 2) инкубация с радиоактивной меткой - 3H- тимидина ; 3) оценка результатов проводится аналогично РБТЛ

Смешанная культура лимфоцитов.

Недостатки клеточных методов Большие затраты времени (около недели). Большие затраты времени (около недели). Плохая воспроизводимость. Плохая воспроизводимость. Очень мало доноров гомозиготных клеток. Очень мало доноров гомозиготных клеток.

Популяции лимфоцитов

Т-лимфоциты Т-хелперы, Th0 (наивные) Th1Th2 Т цитотоксические Тимус Контакт с антигеном

Тучные клетки, тромбоциты, Th2 АПК, NK-клетки IL-12, IL- 18, IL-21, IFN-γ IL-4 Т-лимфоциты

Цитокины – небольшие белки (8-80 кДа), действующие аутокринно или паракринно. Интерлейкины Интерлейкины Интерфероны Интерфероны Колониестимулирующие факторы Колониестимулирующие факторы Факторы некроза опухолей Факторы некроза опухолей Факторы роста Факторы роста Хемокины Хемокины Цитокины

T-цитотоксические Поверхностный маркер – СD3 (сигнальный комплекс, связанный с ТкР), CD8 (рецептор к МНС I) Происхождение – из клеток- предшественников в тимусе Основные медиаторы – IL-2, TNF-α, IFN- γ Роль в иммунном ответе – уничтожение вирус-инфицированных клеток

Th0-лимфоциты Поверхностный маркер – СD3, CD4 (рецептор к МНС II) Происхождение – из клеток- предшественников в тимусе Основные медиаторы – IL-2, IL-4, IFN-γ Роль в иммунном ответе – первичное распознавание антигена и превращение в Th1 или Th2

Th1-лимфоциты Поверхностный маркер – CD4, LAG-3 (антиген суперсемейства иммуноглобулин-подобных молекул) Происхождение – из Th0 Основные медиаторы – IL-2, TNF-α, IFN- γ Роль в иммунном ответе – стимуляция макрофагов при хроническом воспалении (реакции ГЗТ), торможение функций Th2

Th2-лимфоциты Поверхностный маркер – CD4, CD30 (семейство рецепторов для TNF-α) Происхождение – из Th0 Основные медиаторы – IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 Роль в иммунном ответе – стимуляция В-лимфоцитов и секреции Ig (в т.ч. IgE), торможение функций Th1

Functions of Th1 and Th2 Cells Th1 cell Th2 cell Macrophage B cell IFNγ Activates IL-4 IL-5 IL-10 Activates Inhibits production Inhibits proliferation Mast cell Eosinophil Antibodies (including IgE)

В-лимфоциты CD19, CD21 (субъединицы В-клеточного ко- рецептора), CD20 (образование Са 2+ -каналов) Две популяции В1 (СD5+) и В2 (CD5-) В1 – появляются до рождения, секретируют преимущественно IgM, локализуются в лимфоидных скоплениях слизистых оболочек и кожи В2 – появляются после рождения, являются главной популяцией В-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах

NK-лимфоциты Фенотип – CD3- CD16+ CD56+ CD94+ CD16 – рецептор к Fc, CD56 – молекула адгезии нервных клеток, CD94 – связывание с MHC I Роль в иммунном ответе – распознают клетки, у которых отсутствует экспрессия молекулы MHC I, антителозависимая цитотоксичность

Иммунный ответ

Периферические лимфоидные органы являются фильтрами, барьерами, где происходит захват антигена, его расщепление и распознавание.

Лимфатические узлы Фильтрация лимфы и тканевой жидкости Фильтрация лимфы и тканевой жидкости Т-клетки 60-75%, В-клетки – 15-20% всех лимфоцитов Т-клетки 60-75%, В-клетки – 15-20% всех лимфоцитов Преимущественно, клеточный иммунный ответ Преимущественно, клеточный иммунный ответ Гуморальный – преобладают IgM и IgG Гуморальный – преобладают IgM и IgG

Селезенка Фильтрация крови Фильтрация крови Т-клетки 45-60%, В-клетки – 35-45% всех лимфоцитов Т-клетки 45-60%, В-клетки – 35-45% всех лимфоцитов Клеточный иммунный ответ = гуморальный иммунный ответ Клеточный иммунный ответ = гуморальный иммунный ответ Гуморальный – преобладают IgM и IgG Гуморальный – преобладают IgM и IgG

MALT Лимфоидные скопления по ходу слизистых оболочек Лимфоидные скопления по ходу слизистых оболочек Т-клетки 50-70%, В-клетки – 25-40% всех лимфоцитов Т-клетки 50-70%, В-клетки – 25-40% всех лимфоцитов Преимущественно, гуморальный иммунный ответ Преимущественно, гуморальный иммунный ответ Гуморальный – преобладают IgА и IgЕ Гуморальный – преобладают IgА и IgЕ

Антиген-презентирующие клетки Макрофаги Макрофаги Дендритные клетки Дендритные клетки В-лимфоциты В-лимфоциты

Презентация антигена Поглощение антигена – фагоцитоз, пиноцитоз, макропиноцитоз Поглощение антигена – фагоцитоз, пиноцитоз, макропиноцитоз Расщепление антигена на короткие пептидные фрагменты (процессинг антигена) Расщепление антигена на короткие пептидные фрагменты (процессинг антигена) Предъявление антигенных фрагментов в ассоциации с МНС Т-лимфоцитам Предъявление антигенных фрагментов в ассоциации с МНС Т-лимфоцитам Экспрессия дополнительных молекул активации Т-лимфоцитов и секреция цитокинов Экспрессия дополнительных молекул активации Т-лимфоцитов и секреция цитокинов

Презентация антигена

Эффекторные механизмы Цитотоксическое действие Т-клеток CD8+ или NK-лимфоцитов Цитотоксическое действие Т-клеток CD8+ или NK-лимфоцитов Активация макрофагов, регулируемая Th1 Активация макрофагов, регулируемая Th1 Синтез антител, стимулируемый Th2 Синтез антител, стимулируемый Th2

Эффекторные механизмы

Цитотоксичность Т- и NK- лимфоцитов Внутриклеточно локализованные возбудители, в основном вирусы Внутриклеточно локализованные возбудители, в основном вирусы CD8+, NK-клетки, иногда клетки миелоидного ряда CD8+, NK-клетки, иногда клетки миелоидного ряда Презентация через МНС I (для CD8) Презентация через МНС I (для CD8) Секреция IL-2, TNF-α, IFN-γ Секреция IL-2, TNF-α, IFN-γ Результат – лизис инфицированной клетки (ферментативное повреждение – перфорин, гранзимы; либо передача сигнала к апоптозу при непосредственном контакте или через цитокины) Результат – лизис инфицированной клетки (ферментативное повреждение – перфорин, гранзимы; либо передача сигнала к апоптозу при непосредственном контакте или через цитокины)

Клеточный иммунный ответ

Steps in Tc Killing Tc cell 1. Tc recognizes antigen on target cell Target cell Tc cell 2. A lethal hit is delivered by the Tc using agents such as perforin or granzyme B Target cell Tc cell 3. The Tc detaches from the target cell Target cell 4. Target cell dies by apoptosis Target cell

Хроническое воспаление (реакция ГЗТ) Микроооганизмы, опухолевые клетки Микроооганизмы, опухолевые клетки Макрофаги, CD4+ (Th0 Th1) Макрофаги, CD4+ (Th0 Th1) Презентация через МНС II Презентация через МНС II Секреция IL-2, TNF-α, IFN-γ Секреция IL-2, TNF-α, IFN-γ Результат – переваривание антигена в гранулеме либо ее осумковывание и кальцификация Результат – переваривание антигена в гранулеме либо ее осумковывание и кальцификация

Гуморальный иммунный ответ Т-зависимые, Т-независимые антигены Т-зависимые, Т-независимые антигены АПК, CD4+ (Th0 Th2), В-лимфоциты плазматические клетки АПК, CD4+ (Th0 Th2), В-лимфоциты плазматические клетки Презентация через МНС II Презентация через МНС II Секреция IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 Секреция IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 Результат – связывание антител с бактериями, вирусами токсинами, их лизис и фагоцитоз Результат – связывание антител с бактериями, вирусами токсинами, их лизис и фагоцитоз

Гуморальный иммунный ответ

Class II MHC APC Th cell B cell Th cell B cell B cell B cell takes up and presents antigen Th cell B cell Th cells are primed by antigen- presenting cell B-T cell cooperation B cells receive signals from T cells B cells divide B cell B cell B cell B cell Antibody forming cell Antibody forming cell Antibody forming cell Antibody forming cell Antibody forming cell Antibody forming cell B memory cell

Гуморальный иммунный ответ

Формирование иммунологической памяти Срок жизни – месяцы, годы. Срок жизни – месяцы, годы. CD8+, CD4+ Th1, CD4+ Th2, B-клетки CD8+, CD4+ Th1, CD4+ Th2, B-клетки Предактивированное состояние Предактивированное состояние Высокоаффинные антитела Высокоаффинные антитела

Методы исследования клеточного иммунитета

Реакция розеткообразования Т-лимфоциты (Е-РОК) – образование розеток с эритроцитами барана Примерно соответствует CD2+ (рецептор для LFA-3, молекула адгезии) Теофиллинрезистентные – Th, CD4+ Теофиллинчувствительные – CD8+ В-лимфоциты (М-РОК) – образуют розетки с эритроцитами мыши

Реакция бласттрансформации Активация лимфоцитов под воздействием митогенов (ФГА для Т-лимфоцитов, митоген лаконоса для В-лимфоцитов) или специфических антигенов. Наиболее распространен вариант с включением меченного тимидина

Реакция торможения миграции лейкоцитов Выявление факторов торможения, секретируемых активированными лимфоцитами – либо фактора торможения миграции макрофагов, либо фактора торможения миграции лейкоцитов, после контакта с антигеном или митогенной стимуляции.

Иммунофлюоресценция Ag Fluorochrome Labeled Ab Tissue Section Ag Fluorochrome Labeled Anti-Ig Tissue Section Unlabeled Ab Прямая Непрямая

Проточная цитофлюорометрия Аргоновый лазер с воздушным охлаждением Линзы для фокусирования луча Высокочувствительная кварцевая проточная ячейка Детектор светорассеяния в прямом направлении Детектор 90 о светорассеяния FL1 (FITC) FL2 (RD1) FL3 (ECD) FL4 (PC5)

Проточная цитофлюорометрия Лазер Side Scatter (SSC) 90° deflection ~ структура Forward Scatter (FSC) < 10° deflection ~ размер Интенсивность флюоресценции ~ непрозрачность антигена

Проточная цитофлюорометрия Lymphocytes Monocytes Granulocytes

Проточная цитофлюорометрия Green Fluorescence Intensity Number of Cells Unstained cells FITC-labeled cells One Parameter Histogram Red Fluorescence Intensity Green Fluorescence Intensity Two Parameter Histogram