Компоненты ИФА Аналит – определяемое вещество Аналит – определяемое вещество Лиганд – вещество избирательно связывающееся с аналитом Лиганд – вещество избирательно связывающееся с аналитом Метка – легкоопределяемое соединение, добавляемое в анлитическую систему для измерения количества аналита Метка – легкоопределяемое соединение, добавляемое в анлитическую систему для измерения количества аналита

Авидность – прочность комплекса АГ-Ат Авидность – прочность комплекса АГ-Ат Афинность – сродство активного центра Ig с АГД Афинность – сродство активного центра Ig с АГД

Иммуноферментный анализ Гомогенный - все 3 стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся ИК от непрорегировавших компонентов. Для определения низкомолекулярных субстанций. Гомогенный - все 3 стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся ИК от непрорегировавших компонентов. Для определения низкомолекулярных субстанций.

Иммуноферментный анализ Гетерогенный – анализ проводится в двухфазной системе с участием твердой фазы (носителя) и обязательной стадией разделения ИК от непрореагировавших компонентов (отмывка). Гетерогенный – анализ проводится в двухфазной системе с участием твердой фазы (носителя) и обязательной стадией разделения ИК от непрореагировавших компонентов (отмывка). Гетерогенные методы, в которых формирование ИК на 1 стадии протекает на твердой фазе,называют твердофазными. Гетерогенные методы, в которых формирование ИК на 1 стадии протекает на твердой фазе,называют твердофазными.

Гетерогенный твердофазный ИФА По типу реагентов присутствующих первой стадии: По типу реагентов присутствующих первой стадии:1.Конкурентный На первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним. На первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним. 2. Неконкурентный – характерно присутствие в системе на 1 стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

Этапы ИФА Взаимодействие аналита с лигандом Взаимодействие аналита с лигандом Формирование меченного комплекса Формирование меченного комплекса Измерение сигнала Измерение сигнала

Конкурентный ИФА для определения антигенов Искомый антиген(1) и меченыйферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе. Искомый антиген(1) и меченыйферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе.

. Определение АТ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным АГ (прямой ИФА)

Определение АГ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным АТ)прямой ИФА

Твердая фаза Полистирол,поливинилхлорид,полипропилен Полистирол,поливинилхлорид,полипропилен устойчивость к растворам, используемым в реакциях устойчивость к растворам, используемым в реакциях наличие высокой специфической емкости, т.е. способности сорбировать на своей поверхности АГ или АТ в количествах, необходимых для проведения реакции наличие высокой специфической емкости, т.е. способности сорбировать на своей поверхности АГ или АТ в количествах, необходимых для проведения реакции низкая неспецифическая сорбция белков из исследуемых образцов и конъюгатов низкая неспецифическая сорбция белков из исследуемых образцов и конъюгатов Пути решения этой проблемы: Пути решения этой проблемы: добавить белок, заполняющий свободные центры связывания на поверхности пластика «забивка» добавить белок, заполняющий свободные центры связывания на поверхности пластика «забивка» развести сыворотку в раз развести сыворотку в раз Иногда забивку совмещают с разведением Иногда забивку совмещают с разведением

Конъюгат Конъюгат – продукт химической сшивки АТ ( АГ) с ферментным маркером (вторые АТ). Конъюгат – продукт химической сшивки АТ ( АГ) с ферментным маркером (вторые АТ). Используют АТ к Ig того класса, который мы желаем выявить. Используют АТ к Ig того класса, который мы желаем выявить.

Конъюгат должен обладать следующими свойствами Высоким антительным титром и высокой афинностью к АГ. Высоким антительным титром и высокой афинностью к АГ. Достаточной специфичностью в рабочем разведении Достаточной специфичностью в рабочем разведении Преобладанием мономерных форм над полимерными Преобладанием мономерных форм над полимерными Оптимальным молярным соотношением между ферментом и АТ (1:1) Оптимальным молярным соотношением между ферментом и АТ (1:1) Достаточной ферментативной активностью Достаточной ферментативной активностью

Субстрат Бесцветное вещество –хромоген Бесцветное вещество –хромоген Ортофенилендиамин Ортофенилендиамин Тетрамитилбензидин Тетрамитилбензидин

Основные требования к субстрату Обеспечение высокой чувствительности Обеспечение высокой чувствительности Образование хорошо учитываемых продуктов реакции фермент-субстрат Образование хорошо учитываемых продуктов реакции фермент-субстрат Должен быть безопасным, дешевым, доступным,удобным в применении. Должен быть безопасным, дешевым, доступным,удобным в применении. Чаще используют хромогенные субстраты, которые разрушаясь образуют окрашенное вещество Чаще используют хромогенные субстраты, которые разрушаясь образуют окрашенное вещество

Ферменты и субстраты, наиболее широко используемые в ИФА ФерментИсточник получения Молек. масса(к Да) Субстрат (рекоменд.длинаКонъюгирующий реагент волны при фотометр.,нм) Пероксидаза хренаХрен40O- фенилендиаминдигидрохлор ид 1.Глутаральдегид (Armoracia(ОФД,492 нм),2.Мета-периодат натрия Rusticana)5-аминосалициловая кислота(450 нм), диаминобензидин, о- дианизидин 3.N-сукцинимидил - 3 пропионат β -галактозидазаEscherichia540О-нитрофенил-β-D-галактозидМета- малеимидобензо л-N- гидроксисукцин имидный эфир Coli(420 нм) Щелочная форфатаза E.coli,слизистая кишечника теленка Р-нитрофенилфосфат(405нм)Глутаралдегид 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат

Этапы проведения ИФА Положительный результат Отрицательный результат Отрицательный результат

Добавление аналита

Добавление конъюгата Положительный результат Положительный результат Отрицательный результат Отрицательный результат

Схема взаимодействия активного центра АТ и антигенной детерминанты

Определение АТ Сероконверсия Сероконверсия первая сыворотка отрицательная первая сыворотка отрицательная Вторая -положительная Вторая -положительная

Метод «парных сывороток» Сравнение двух последовательных анализов, причем повторный анализ рекомендуется делать через дней Сравнение двух последовательных анализов, причем повторный анализ рекомендуется делать через дней

Иммуноглобулин G Строение Строение

Иммуноглобулины IgM определение АТ этого класса необходимо для диагностики острого периода заболевания IgM определение АТ этого класса необходимо для диагностики острого периода заболевания IgG появляются в период реконвалесценции и у переболевших сохраняются 10 лет и более.Используется для оценки напряженности поствакцинального иммунитета и определение инфекции в анамнезе. IgG появляются в период реконвалесценции и у переболевших сохраняются 10 лет и более.Используется для оценки напряженности поствакцинального иммунитета и определение инфекции в анамнезе.

Определение специфических IgE IgE специфический АГ на бумажном диске

Определение специфических IgE HPR развитие цветной реакции

СА-242 («сэндвич» вариант ИФА)

Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ Твердая фаза –МАТ против р24 ВИЧ 1 Конъюгаты -1. Биотил.анти-р24 2.Авидин-пероксидазный Сыворотка/плазма Твердая фаза Коньюгат ВИЧ АГ

Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТ Твердая фаза-gp160, gp36, композ.пептид Конъюгат – gp41,gp36 и пероксидаз. конъюгаты Сыворотка/плазма Твердая фаза Коньюгат IgG, IgA, IgM

Тест полоски - Иммунодот Комбинация АГ на полосках Название набора MONO IgG ( инфекционный Мононуклеоз ) +EBV VCA G EBNA 1G CMVG Toxo G O

Преимущества ИФА Высокой чувствительностью, позволяющей определять концентрации до 0,05 нг/мл Высокой чувствительностью, позволяющей определять концентрации до 0,05 нг/мл Минимальные объемы исследуемого материала Минимальные объемы исследуемого материала Стабильностью при хранении всех ингредиентов Стабильностью при хранении всех ингредиентов Простотой проведения реакции Простотой проведения реакции Наличием как инструментального, так и визуального учета Наличием как инструментального, так и визуального учета Возможностью автоматизации всех этапов реакции Возможностью автоматизации всех этапов реакции Относительно низкой стоимостью диагностических наборов Относительно низкой стоимостью диагностических наборов

Полезные советы Выбор фирмы поставщика Выбор фирмы поставщика o Цена не должна быть приоритетом o Желательно комплектация 1-3 уровнями контр.кач. o Совместимость с международ. контр.материалами o Стабильность реагентов после открытия набора o Срок годности тест-системы

Неправильная форма калибровочной кривой Не правильно приготовлен раствор стандарта Не правильно приготовлен раствор стандарта Стандарт не был разбавлен разбавителем стандарта или рабочим буфером Стандарт не был разбавлен разбавителем стандарта или рабочим буфером Неправильная промывка Неправильная промывка Ошибка при внесении стандарта или последующих шагах Ошибка при внесении стандарта или последующих шагах Использование реагентов из других наборов или наборов другого лота Использование реагентов из других наборов или наборов другого лота

Полезные советы Точность пипетирования ( от ячейки к ячейки не > 2%) Точность пипетирования ( от ячейки к ячейки не > 2%) Не хранить реагенты в саморазмораживающимся холодильнике Не хранить реагенты в саморазмораживающимся холодильнике Не используйте инкубаторы с конвективным нагревом Не используйте инкубаторы с конвективным нагревом Оптимальное промывание Оптимальное промывание Регулярно проверять точность работы обрудования Регулярно проверять точность работы обрудования Рекомендуется, чтобы все сыворотки анализ. в дублях Рекомендуется, чтобы все сыворотки анализ. в дублях (разброс для 1 образца не > 5%) (разброс для 1 образца не > 5%)

Проблемы ИФА Повышенный фон Повышенный фон o Недостаточная промывка o Контаминация субстрата ионами металлов или окисляющими реагентами o Загрязнение дозатора или субстрата конъюгатом стрептовидина с ПХ o Неправильное разведение конъюгата Стреп.сПХ o Хромоген. субстрат находился на свету o Неправиьное время/ или Т 0 инкубации o Испарение содержимого во время инкубации o Неправильное количество ФК или ХС

Повышенные оптические плотности образцов/стандартов Не правильно разбавлены стандарты, конъюгаты Не правильно разбавлены стандарты, конъюгаты Микропланшет накрыт пленкой во время инкубации с субстратом Микропланшет накрыт пленкой во время инкубации с субстратом Превышение времени инкубации Превышение времени инкубации Нарушение Т 0 режима Нарушение Т 0 режима Контаминация наконечника, субстрата Ф.К. Контаминация наконечника, субстрата Ф.К. Субстрат находился на свету перед использованием Субстрат находился на свету перед использованием

Отсутствие или слабое развитие окраски Реагенты не достигли комнатной Т 0 (25±20) Реагенты не достигли комнатной Т 0 (25±20) Не правильное хранение набора Не правильное хранение набора Инкубация с Ф.К. при 37 0 вместо комнатной Т 0 Инкубация с Ф.К. при 37 0 вместо комнатной Т 0 Пропущена одна из инкубаций Пропущена одна из инкубаций Высыхание ячеек в ходе проведения анализа Высыхание ячеек в ходе проведения анализа Использование неподходящего субстрата или стоп-реагент. Использование неподходящего субстрата или стоп-реагент. Низкая Т 0 в помещении

Советы Спектрофотометр перед измерением прогреть Спектрофотометр перед измерением прогреть 1 включение = 40 минут работы лампы 1 включение = 40 минут работы лампы Увеличение сигнала при использовании марли обработанной хлорамином Увеличение сигнала при использовании марли обработанной хлорамином Дистиллированная вода комн.Т. Не хранить воду более 2-3 дней. Дистиллированная вода комн.Т. Не хранить воду более 2-3 дней. Планшет для предварит. Разведения использовать однократно. Планшет для предварит. Разведения использовать однократно.

Советы Не сокращать время инкубации с ОФД Не сокращать время инкубации с ОФД Не допускать подсыхания лунок Не допускать подсыхания лунок При промывке лунки заполняются до самого верха При промывке лунки заполняются до самого верха Особенно тщательно промывать после инкубации с конъюгатом Особенно тщательно промывать после инкубации с конъюгатом При отказе спектрофотометра – добавить стоп-реагент и быстро заморозить При отказе спектрофотометра – добавить стоп-реагент и быстро заморозить

Сомнительный результат Ошибка дозирования 5% Ошибка дозирования 5% Ошибка измерения спектрофотометра 10% Ошибка измерения спектрофотометра 10% Серая зона Серая зона Сыворотки, оптическая плотность которых отличается не более 15% от ОП крит следует признать сомнительными Сыворотки, оптическая плотность которых отличается не более 15% от ОП крит следует признать сомнительными

Сut off Пороговое значение, превышение которого является положительным результатом Пороговое значение, превышение которого является положительным результатом

ОФД, ТМБ Отдельная посуда и наконеники Отдельная посуда и наконеники Обработка 50% спиртом Обработка 50% спиртом Промыть дистиллированной водой Промыть дистиллированной водой Измерять оптическую плотность не позже 30 мин Измерять оптическую плотность не позже 30 мин

Автоматические пипетки Погрешность пипеток не должна превышать 5% Погрешность пипеток не должна превышать 5% 1мкл Н 2 0 =1мг 1мкл Н 2 0 =1мг Дозирование объема менее 10 мкл Дозирование объема менее 10 мкл

Сбор, подготовка и транспортировка образцов для исследования на наличие антител к вирусу краснухи класса IgM и IgG Материал для исследования - сыворотка крови. Материал для исследования - сыворотка крови. Тестированию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, бактериальной контаминации, хилеза, гемолиза.При наличии любого из указанных признаков сыворотка уничтожается и назначается повторный забор крови. Тестированию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, бактериальной контаминации, хилеза, гемолиза.При наличии любого из указанных признаков сыворотка уничтожается и назначается повторный забор крови. Приготовление сыворотки. Приготовление сыворотки. Венозная кровь берется без антикоагулянта. Отстаивается при комнатной температуре (15- 20град) в течении 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой стеклянной палочкой по внутренним стенкам пробирки для стделения сгустка от стенок пробирки.Сыворотку сливают в другую центрифужную пробирку, придерживая сгусток стеклянной палочкой, и центрифугируют, либо центрифугируют в тех же, первичных, пробирках. Венозная кровь берется без антикоагулянта. Отстаивается при комнатной температуре (15- 20град) в течении 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой стеклянной палочкой по внутренним стенкам пробирки для стделения сгустка от стенок пробирки.Сыворотку сливают в другую центрифужную пробирку, придерживая сгусток стеклянной палочкой, и центрифугируют, либо центрифугируют в тех же, первичных, пробирках. После центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка и клеток крови и помещают в холодильник при град. При необходимости более длительного хранения ее необходимо хранить при - 20 град. Допускается замораживать сыворотку только 1 раз. После центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка и клеток крови и помещают в холодильник при град. При необходимости более длительного хранения ее необходимо хранить при - 20 град. Допускается замораживать сыворотку только 1 раз. Условия транспортировки. Условия транспортировки. Правильно собранная сыворотка должна быть своевременно доставлена в лабораторию. Сыворотка крови стабильна при град в течении 12 часов. Правильно собранная сыворотка должна быть своевременно доставлена в лабораторию. Сыворотка крови стабильна при град в течении 12 часов. Во время транспортировки пробирки с сывороткой должны быть соответствующим образом защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. Пробирки должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты. Во время транспортировки пробирки с сывороткой должны быть соответствующим образом защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. Пробирки должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты. Минимальное количество сыворотки, необходимое на 1 исследование мкл. Минимальное количество сыворотки, необходимое на 1 исследование мкл. Для определения динамики антителообразования сыворотку исследуют дважды. Для определения динамики антителообразования сыворотку исследуют дважды. Интервал между исследованиями 1-2 недели. ( метод "парных" сывороток) Интервал между исследованиями 1-2 недели. ( метод "парных" сывороток)

Спектрофотометры Спектрофотометры Спектрофотометры Спектрофотометры Обычно требуют длительного времени прогрева (указано в инструкции). Поэтому если ожидается измерение оптической плотностичерез 30 мин после очередного измерения, прибор лучше оставить включенным ( 1 включение равносильно 40 мин работы лампы). Обычно требуют длительного времени прогрева (указано в инструкции). Поэтому если ожидается измерение оптической плотностичерез 30 мин после очередного измерения, прибор лучше оставить включенным ( 1 включение равносильно 40 мин работы лампы). Спектрофотометры имеют допустимую погрешность измерения до 10%.Проверить это можно, промеряя дважды один и тотже планшет и вычисляя различие в величине оптической плотности в одинаковых лунках. При этом планшет разворачивают так, чтобы лунка А1 заняла место Н12. Спектрофотометры имеют допустимую погрешность измерения до 10%.Проверить это можно, промеряя дважды один и тотже планшет и вычисляя различие в величине оптической плотности в одинаковых лунках. При этом планшет разворачивают так, чтобы лунка А1 заняла место Н12. При оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность спектрофотометра может возрастать. При оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность спектрофотометра может возрастать.

Марля или фильтровальная бумага При многократном использовании марли, обработанной хлорамином, возможно повышение сигнала (при попадании хлорамина в лунки) При многократном использовании марли, обработанной хлорамином, возможно повышение сигнала (при попадании хлорамина в лунки)

Дистиллированная вода Не хранить более 2-3 дней. Не добавлять азид натрия в качестве консерванта.. Он является ингибитором пероксидазы. Если вода хранилась в холодильнике, необходимо прогреть до комнатной t°. Не хранить более 2-3 дней. Не добавлять азид натрия в качестве консерванта.. Он является ингибитором пероксидазы. Если вода хранилась в холодильнике, необходимо прогреть до комнатной t°.

Планшет для предварительного разведения сывороток Использовать однократно. Использовать однократно.

Инструкции по применению –При получении новой серии наборов даже хорошо знакомой тест-системы – необходимо прочитать инструкцию. –Сознательные нарушения инструкции – сокращение времени инкубации с р-ром субстрата.Такие изменения протокола ИФАмогут существенно снизить выявляемость слабоположительных образцов, т.е. привести к ложноотрицательным результатам. –Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной Т° для предотвращения конденсации влаги на планшете если планшет разборный и используются не все стрипы сразу,то после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, край покета завернуть и зажать скрепками.Не следует удалить покетик с влагопоглотителем. –Для предотвращения загрязнения не следует трогать верхнюю часть стрипов пальцами. –Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны. –В случае необходимостидлительного перерыва следует положить планшет вверх донышками на смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу. –Реакция связывания АТ с АГ начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, поэтому желательно уменьшить период между внесением первой и последней сыворотки в планшет. –Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением. –Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюгата.

Отказ спектрофотометра Быстро заморозить планшет после добавления серной кислоты с последующим быстрым оттаиванием перед измерением оптической плотности.Следует учмтывать, что о.п. все-таки возрастает, а относительный прирост сигнала более высок для небольших значений о.п. Быстро заморозить планшет после добавления серной кислоты с последующим быстрым оттаиванием перед измерением оптической плотности.Следует учмтывать, что о.п. все-таки возрастает, а относительный прирост сигнала более высок для небольших значений о.п.

Отказ термостата Универсальных рецептов нет Универсальных рецептов нет

Ошибки при постановки ИФА Инкубация при комнатной t° (18-25°) Инкубация при комнатной t° (18-25°) На практике t° в помещениях лабораторий варьирует от 12-30°. Общих формул оценки влияния соотношения t° и времени инкубации на оптическую плотность не существует.Единственный способ избежать ошибки – установка планшета в термостат, настроенный на комнатную t°. На практике t° в помещениях лабораторий варьирует от 12-30°. Общих формул оценки влияния соотношения t° и времени инкубации на оптическую плотность не существует.Единственный способ избежать ошибки – установка планшета в термостат, настроенный на комнатную t°. Перед постановкой тест-системы концентраты р-ров необходимо развести дистиллированной водой. Вода должна иметь комнатную t°. Особенно это важно для разведения конъюгата и сывороток. Вероятность получения неправильного результата выше, если продолжительность инкубации мала (30мин) Перед постановкой тест-системы концентраты р-ров необходимо развести дистиллированной водой. Вода должна иметь комнатную t°. Особенно это важно для разведения конъюгата и сывороток. Вероятность получения неправильного результата выше, если продолжительность инкубации мала (30мин)

Относительная влажность воздуха Относительная влажность воздуха Относительная влажность воздуха Длительная инкубация при комнатной t°, при сухом воздухе(зимой) может вызвать подсыхание р-ра с образованием «ободка» на боковой поверхности лунки, который при промывки может сохраниться. Лучше использовать влажную камеру. Длительная инкубация при комнатной t°, при сухом воздухе(зимой) может вызвать подсыхание р-ра с образованием «ободка» на боковой поверхности лунки, который при промывки может сохраниться. Лучше использовать влажную камеру.

Промыватели планшетов Засорение каналов промывателей.недостаточная промывка приводит к завышению сигнала.Обнаружить это просто – при использовании рядного промывателяповышенный сигнал имеет один из рядов, при использовании 96-канального – одна и таже лунка разных планшетов Засорение каналов промывателей.недостаточная промывка приводит к завышению сигнала.Обнаружить это просто – при использовании рядного промывателяповышенный сигнал имеет один из рядов, при использовании 96-канального – одна и таже лунка разных планшетов Менее частовстречается засорение пространства между иглами промывателя кусочками марли или ваты.Это приводит к заносу растворов из одной лунки в другие. Менее частовстречается засорение пространства между иглами промывателя кусочками марли или ваты.Это приводит к заносу растворов из одной лунки в другие.