Хориоретинальная дистрофия: особенности развития при преждевременном старении и коррекция митохондриальным антиоксидантом SkQ – патологическая физиология ФУРСОВА АНЖЕЛЛА ЖАНОВНА Научный консультант – д.б.н. Н.Г.Колосова Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

В мире человек слепых и слабовидящих, среди них слепых – Причины: - 47% – катаракта, - 9% – макулодистрофия. Возрастная макулодистрофия: Европа и США – 1-е место, Азия – 2-е место. В России макулодистрофия становится причиной слепоты в 22% случаев (Е.С.Либман, 2006) % россиян в возрасте старше 65 лет страдают этим заболеванием.

Проявления преждевременного старения крыс OXYS: Ранняя спонтанная катаракта Продолжительность жизни снижена. Ранняя инволюция тимуса, снижение реактивности клеточного звена иммунной системы. Ранний остеопороз. Изменения в когнитивной и эмоциональной сферах, свойственные стареющим людям и животным. Повышено артериальное давление.

Цель работы: исследование особенностей развития хориоретинальной дистрофии у преждевременно стареющих крыс OXYS и оценка терапевтического потенциала митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1.

Задачи: 1. Охарактеризовать клинические особенности развития патологических изменений сетчатки и хрусталиков у крыс OXYS. 2. Провести морфологическое исследование тканей хориоретинального комплекса и изучить особенности развития ХРД у крыс OXYS. 3. Оценить уровень экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в тканях внутренней оболочки глаз крыс OXYS на разных стадиях развития ХРД. 4. Установить связь развития катаракты и ХРД у крыс OXYS с окислительным стрессом и оценить возможность воздействия на их течение методами стандартной терапии с использованием препаратов со свойствами антиоксидантов. 5. Изучить влияние митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 на развитие хориоретинальной дистрофии и катаракты у крыс OXYS и связь его эффектов с влиянием на экспрессию гена VEGF хориоретинальном комплексе и альфа-кристаллинов в хрусталиках.

Методы исследования Офтальмологические методы: осмотры с помощью прямого офтальмоскопа "Betta" с насадкой щелевой лампы. Биомикроскопическое исследование щелевой лампой SL-45 Shin Nippon. Исследование глазного дна с помощью Фундус-камеры «Оpton». Электроретинография. Морфологические методы: Световая и электронная микроскопия Молекулярно-биохимические методы: ПЦР в реальном времени, стандартные биохимические методы Животные: 1710 крыс OXYS и Вистар, возраст от 20 дней до 24 мес.

Распределение крыс Вистар и OXYS разного возраста по стадиям развития катаракты

Ядерная катаракта, крыса OXYS OXYS Вистар Эпителиоциты экваториальной зоны Электронно-микроскопическая картина изменений хрусталиков крыс OXYS OXYS Вистар OXYS

,5 0,7 1 стадия 2 стадия 3 стадия % от общего количества животных Возраст животных, месяцев В 98% случаев катаракта у крыс OXYS развивается на фоне дистрофических изменений сетчатки. Зависимость распределения по ХРД стадиям от возраста

Основные клинические проявления дистрофии сетчатки аналогичны у людей …и крыс OXYS:

Флуоресцентная ангиография глазного дна крыс OXYS. а - зоны атрофии пигментного эпителия; б – субретинальная транссудация, отслойка РПЕ, в - отслойка нейроэпителия с участками субретинальной новообразованной мембраны а бв а б в г д ЭРГ крыс OXYS разного возраста: а - супернормальная ЭРГ, возраст 3 мес.; б – негативная ЭРГ, возраст 6 мес.; в- нормальная ЭРГ, возраст 3 нед. ; г - субнормальная ЭРГ, возраст 7 мес.; д – нерегистрируемая ЭРГ, возраст 12 мес.

Крыса Wistar, 24 мес.: нормальное строение сетчатки глаза. (×400, окраска гематоксилин- эозин). Хориоретинальный комплекс крыс OXYS разного возраста (× 400, гематоксилин-эозин ). 3 мес., отек в слое ганглиозных клеток сетчатки. Ядра отодвинуты от внутренней пограничной мембраны. 24 мес., тотальный фиброз хориоидеи, просветы сосудов не определяются.

Х ПЭ НЯС ФС Стаз форменных элементов в сосудах хориоидеи крыс OXYS. ПЭ ФС ПЭ Х Расслоение и фрагментация наружных сегментов фоторецепторов сетчатки крыс OXYS ВЯС ФС НЯС Пикноз ядер нейросенсорных клеток в наружном ядерном слое сетчатки крыс OXYS Возраст животных – 5 месяцев

Ультраструктура пигментного эпителия Крыса Wistar в возрасте 11 мес. Крыса OXYS в возрасте 11 мес. 3,56±0,21*OXYS 5,43±0,1Вистар Удельная площадь пигментного эпителия сетчатки (%) Линия крыс

Развитие у крыс OXYS хориоретинальной дистрофии по клиническим и морфологическим проявлениям соответствует возрастной макулодистрофии людей, развивается параллельно с формированием катаракты и является одним из проявлений преждевременного старения. 1-е положение, выносимое на защиту:

У крыс OXYS (70-80 поколения) манифестация хориоретинальной дистрофии и катаракты по времени опережает появление признаков окислительного стресса. Линия ХрусталикСетчатка Диеновые конъюгаты, Е 232 нм на мг липидов Основания Шиффа, отн ед на мг липидов Диеновые конъюгаты, Е 232 нм на мг липидов Основания Шиффа, отн ед на мг липидов Wistar 3,63 0,3717,56 1,00 1,88 ± 0,1112,48 ± 0,99 OXYS 2,63 0,6116,64 1,40 2,05 ± 0,0815,02 ± 0,83 Содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови Содержание продуктов ПОЛ в сетчатке и хрусталиках глаз крыс Wistar и OXYS в возрасте 3 месяцев (M m).

Экспрессия гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс OXYS при развитии ХРД Выраженность патологических изменений сетчатки зависит от уровня экспрессии гена VEGF: в возрасте 3 мес. связь отрицательная (r = -0,61, p=0,028); при развитых стадиях заболевания связь положительная (r=0,69, p

В основе патогенеза ХРД у крыс OXYS лежат склеротические повреждения сосудов хориоидеи, нарушение кровотока в них, деструкция пигментного эпителия, изменение уровня экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в хориоретинальном комплексе: снижение экспрессии на ранних стадиях заболевания и повышение по мере его прогрессирования. 2-е положение, выносимое на защиту:

На развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS влияют стандартные препараты с антиоксидантной активностью. Результаты свидетельствуют в пользу адекватности модели, а также о связи патогенеза катаракты и ХРД у крыс OXYS с окислительным стрессом.

SkQ1 «Локомотив» Антиоксидант SkQ1 – «ионы Скулачёва» - митохондриальный антиоксидант

Влияние препаратов на заболеваемость крыс OXYS катарактой Влияние препаратов на тяжесть течения катаракты Влияние 45-дневного курса SkQ1 (50 нмоль/кг) и витамина Е (20 мг/кг) на развитие катаракты у крыс OXYS Влияние препаратов на заболеваемость

Выраженность патологических изменений Заболеваемость животных Влияние 45-дневного курса SkQ1 (50 нмоль/кг) и витамина Е (20 мг/кг) на развитие ХРД у крыс OXYS (n=15)

Подбор оптимальной профилактической дозы SkQ1 (количество животных в группе - 30) Состояние хрусталиков Состояние сетчатки

Подтверждение - эксперимент 2: дистрофия сетчатки на фоне приёма SkQ1 у крыс OXYS не развивается. Процент глаз с изменениями сетчатки в возрасте 20 мес. Влияние SkQ1 на выраженность патологических изменений сетчатки. Приём препарата с 1,5 мес.

Электроретинография: SkQ1 (250 нмоль/кг с кормом) препятствует развитию нарушений функций сетчатки у крыс OXYS. ЭРГ контрольных крыс OXYS в возрасте 3 и 24 мес. и 24-месячных крыс OXYS, получавших с возраста 1,5 мес. 250 нмоль/кг SkQ1. Амплитуда b волны ЭРГ контрольных крыс OXYS в возрасте 3 и 24 мес. и 24-мес., получавших с 1,5 мес. 250 нмоль/кг SkQ1. *- достоверные отличия по сравнению с 3-мес. крысами, # - значимый эффект SkQ1

SkQ1 (250 нмоль/кг с кормом) предупреждает у крыс OXYS развитие деструктивных изменений сетчатки Крыса OXYS, 24 мес., контроль: наружный ядерный слой редуцирован до 2-х, 3-х рядов. В некоторых ядрах признаки апоптоза. Слой палочек и колбочек разрушен. Крыса OXYS, 24 мес., приём SkQ1 с возраста 1, 5 мес.: хорошо выражен наружный ядерный слой, определяющий расположение тел фоторецепторных клеток. Окраска ГЭ. х 400.

Состояние хрусталиков контрольных и получавших SkQ1 крыс OXYS. Начало приёма препарата – 1,5 мес., Зависимые парные сравнения: катаракта на фоне приёма SkQ1 в дозах 50 и 250 нмоль на кг у крыс OXYS не развивалась.

SkQ1 SkQ1 позитивно влиял на общее состояние крыс OXYS, предупреждал развитие признаков преждевременного старения. Крысы OXYS в возрасте 23 мес. Опытные принимали SkQ1с 1,5 мес. по 250 нмоль/кг с кормом. Контроли

Выявлен профилактический эффект капель SkQ1 – их способность задерживать развитие катаракты и дистрофии сетчатки у крыс OXYS Состояние хрусталиковСостояние сетчатки * # # * # * * Предварительный осмотр 3 1,5 Изменения хрусталиков, баллов Возраст животных, месяцев *- достоверный эффект препарата, # - достоверные различия по сравнению с предыдущим обследованием.

Состояние хрусталиков и сетчатки крыс OXYS до и после приема SkQ1 (50 нмоль/кг с кормом в течение 45 дней). На этой группе животных впервые получен лечебный эффект SkQ1 - его способность снижать выраженность патологических изменений сетчатки и хрусталиков Состояние хрусталиковСостояние сетчатки

Лечебный эффект приёма SkQ1 с кормом (250 нмоль/кг) и в каплях (250нМ) сопоставим Состояние сетчатки Распределение глаз по выраженности патологических изменений сетчатки до и после лечения крыс OXYS

Ретинальный пигментный эпителий контрольных крыс Wistar, OXYS и крыс OXYS, получавших капли SkQ1 (250 nM 2,5 мес.). Эффект SkQ1 связан с изменением состояния митохондрий: увеличением их количества и размеров.

мембрана Бруха капилляр мембрана Бруха капиллярВистар, без SkQ1 OXYS, без SkQ1 OXYS, SkQ1 SkQ1 в 4 раз увеличил количество полноценных капилляров в хориоидее, количество клеток пигментного эпителия, восстановил их функциональную активность.

Количество капилляров (M±SD) с разной степенью деградации на участке длиной 450 мкм (данные В.Б.Сапруновой).. Влияние капель SkQ1 (250 нМ) на состояние капилляров в хориоидее и экспрессию гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс OXYS. * - достоверные межлинейные различия, # - достоверный эффект препарата Уровень экспрессии гена VEGF

Профилактический приём SkQ1 с кормом (250 нмоль/кг) в критический период развития ВМД с 1,5 до 3 мес. # - достоверные отличия с Вистар (p

Выраженность патологических изменений хрусталиков зависит от уровня экспрессии генов αА-( r = -0,53, p

Митохондриальный антиоксидант SkQ1 обладает высоким профилактическим и лечебным потенциалом в отношении катаракты и возрастной макулодистрофии, его эффекты связаны с нормализацией кровотока, восстановлением пигментного эпителия и экспрессии генов: VEGF в хориоретинальном комплексе и α-кристаллинов в хрусталиках. 3-е положение, выносимое на защиту:

Использование линии преждевременно стареющих крыс OXYS позволяет получать объективную оценку эффективности новых способов лечения и профилактики катаракты и возрастной макулодистрофии. 4-е положение, выносимое на защиту:

Выводы: 1. У крыс OXYS параллельно развиваются катаракта и хориоретинальная дистрофия, которые по клиническим проявлениям биомикроскопической и офтальмоскопической картины соответствуют изменениям хрусталика и сетчатки у пациентов с сенильной катарактой и возрастной макулярной дистрофией. 2. Установлены критические периоды развития катаракты и возрастной макулярной дистрофии у крыс OXYS: первые признаки этих заболеваний зарегистрированы в 5-6 недель, активно прогрессирует с возраста 12 месяцев и достигают выраженных стадий, предполагающих потерю или существенное ухудшение остроты зрения к 14–18 месяцам. 3. У крыс OXYS развитие хориоретинальной дистрофии связано с нарушениями кровообращения и транскапиллярного обмена в хориокапиллярах и вызванной этим хронической ишемией, ведущей к структурно-функциональным изменениям пигментного эпителия, дистрофическим изменениям мембраны Бруха и, как следствие, гибели клеток фоторецепторного слоя. 4. Развитие дистрофии сетчатки у крыс OXYS связано с изменениями экспрессии гена VEGF в клетках пигментного эпителия: а) первичные признаки заболевания формируются на фоне его двукратного снижения по сравнению с контролем, когда между тяжестью заболевания и уровнем экспрессией гена VEGF формируется отрицательная связь; б) в период формирования выраженных патологических изменений средние значения уровня экспрессии гена VEGF не отличается от контрольных, но между ним и выраженностью патологических изменений связь становится положительной.

Выводы: 5. Развитие катаракты и хориоретинальной дистрофии у крыс OXYS с различной эффективностью предупреждают стандартные препараты с антиоксидантной активностью, что свидетельствует в пользу адекватности модели, а также о связи патогенеза катаракты и ХРД у крыс OXYS с окислительным стрессом. 6. Митохондриально направленный антиоксидант SkQ1 при его приеме с кормом и в виде капель предупреждает развитие катаракты и дистрофии сетчатки и снижает тяжесть течения этих заболеваний у крыс OXYS. Лечебный эффект SkQ1 наиболее существенно выражен при начальных, не имеющих грубых органических изменений стадиях заболевания. 7. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при ХРД у крыс OXYS связан с нормализацией уровня экспрессии гена VEGF, восстановлением микроциркуляции на фоне снижения признаков склероза и облитерации сосудов, которые обеспечивают трофику и в результате – сохранность фоторецепторов сетчатки. 8. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при лечении катаракты связан с увеличением уровня экспрессии генов α-кристаллинов. 9. Линия преждевременно стареющих крыс OXYS – адекватная модель для исследования этиологии и патогенеза катаракты и ВМД, для оценки эффективности новых способов лечения и профилактики этих заболеваний.

Благодарю за внимание !