Анализ генетических библиотек ! Как найти нужный клон ?

Анализ по проявлению активности продукта клонированного гена Что плохо ?

Взаимодействие с антителами

Поликлональные антитела CC Fc Fab Антиген Метка

Взаимодействие с антителами Фильтр с иммобилизованными белками Блокирование областей неспецифического связывания Обработка антителами Определение ферментативной активности Определение радиоактивности

Что плохо ? ! Вот он !

Гибридизация с олигонуклеотидным зондом Блокирование областей неспецифического связывания

Гибридизация с олигонуклеотидным зондом Искомый ген Синтетический олигонуклеотидный зонд Введение метки Обработка

Что плохо ? ! Вот он !

Откуда узнать последовательность зонда? Определить N-концевую аминокислотную последовательность белка и перевести ее в нуклеотидную по таблице кодонов. Met-Gln-Lys-Phe-AsnATG CAA/G AAA/G TTT/C AAT/C16 Met-Ser-Leu-Gly ATG TCT/C/A/G AGT/C CTT/C/A/G TTA/G GGT/C/A/G 144 Определить (или где-то узнать) аминокислотную последовательность всего белка и выбрать удобную область для перевода в нуклеотидную последовательность. Выравнивание известных последовательностей родственных генов.

Получение зонда при помощи PCR Ген PCR Амплификат Введение метки Зонд

Мы отобрали клон, несущий протяженную вставку, содержащую интересующий нас ген! Что дальше?

Секвенирование Что плохо ?

Рестрикционное картирование и минимизация вставки

Ori 3000 нп EcoRI BamHIHindIII BamHI Sau3A GGATCC CCTAGG GATC CTAG GGATCC CGATCC GGATCA TGATCT Построение рестрикционной карты ФерментыФрагменты (нп) BamHI7000 EcoRI HindIII BamHI+EcoRI BamHI+HindIII EcoRI+HindIII

ФерментыФрагменты (нп) BamHI7000 EcoRI HindIII BamHI+EcoRI BamHI+HindIII EcoRI+HindIII EcoRI HindIII нп EcoRI HindIII BamHI РЕЗУЛЬТАТ

Сайт-направленный мутагенез Как все начиналось. Система фага М13. ssDNA 7,5 тнп ssDNA dsDNA

Вектор на основе М13 dsDNA M13 lacZ pl

Перевод в одноцепочечную форму ssDNA M13 Достраивание и лигирование

Что плохо? ДНК М13 с мутацией

Штамм E.coli dut - ung - dut - утрата dUTPase, приводит к повышению концентрации dU ung- утрата урацил N-гликозилазы – удаление dU из ДНК Результат – включение уридина в ДНК dU – богатая цепь Достройка и лигирование в нормальных условиях

Цепь с мутацией и без dU dU – богатая цепь При введении в обычный штамм E.coli dU-богатая цепь будет расщеплена!

Направленный мутагенез на базе ПЦР Ген ПЦР Амплификат с мутацией Что плохо?

Направленный мутагенез на базе ПЦР. Мегапраймерная схема. ПЦР Амплификат с мутацией Ген R1R2 Ген R1R2 ПЦР R1R2 Мегапраймер