Фрагментный анализ ДНК к.б.н.,Орехов В.А. ООО «ГОРДИЗ» 29 января 2013 г. г. Звенигород

Что такое фрагментный анализ ДНК? Фрагментный анализ ДНК – метод (методы) определения длины ПЦР-продуктов основанные на разделении фрагментов ДНК по молекулярной массе. HPLC (ВЭЖХ) Масспектрометрия Электрофорез

0 Принцип электрофореза

30 Принцип электрофореза

45 Принцип электрофореза

90 Принцип электрофореза

Электрофорез ДНК в геле денатурация

Анализ фрагментов ДНК в ПААГ -Широко использовался до конца 90-х Преимущества: - Не требует дорогостоящего оборудования - Не требует модифицированных праймеров Недостатки: - Высокая трудоемкость - Низкая пропускная способность - Высокая себестоимость анализа (?) - Низкая точность определения размера фрагментов (?)

Стеллан Хьертен Первый автоматизированный прибор для ккапиллярного электрофореза-1967 Университет Упсала(Швеция) От гелей к капиллярному электрофорезу Капилляры Ø3 мм Не приспособлен для анализа ДНК

История ккапиллярного электрофореза ДНК 1988 – Разделение однонитевых олигонуклеотидов в капиллярах заполненных поперечно сшитым гелем (Karger et al., деградация, нет возможности пере заполнения) 1990 – разделение продуктов рестрикции ДНК в жидком полимере (Karger et al., недостаточное разрешение) 1992 – первый коммерческий прибор для капиллярного электрофореза, оснащенный лазером для одноцветной лазерной детекции Beckman P/ACE – Первая демонстрация типирования микро сателлитных маркеров с помощью CE (внутренний стандарт – 2 фрагмента и аллельный лэддер TH01) 1995 – многоцветный генетический анализатор ABI 310 Genetic Analyzer Методу > 20 лет

150 bp 300 bp TH01 allelic ladder Декабрь 1993 Первый анализ STR с помощью CE, 1993 Одноцветный формат Butler et al. (1994) BioTechniques 17:

ABI 3100, 3130XL 16-capillary array ABI 310 single capillary Приборы ккапиллярного электрофореза

Преимущества использования автоматических генетических анализаторов 1.Автоматизация: внесение образца, электрофорез и детекция полностью автоматизированы. 2. Высокая скорость анализа (16 образцов х локусов = > 160 маркеров за 30 мин.) 3. Документирование результатов: Результаты автоматически сохраняются в электронном легко доступном виде. 4. Высокая воспроизводимость результатов изо дня в день (в стандартных условиях!) 5. Точность определения размера фрагментов > 0.5 п.н. (в стандартных условиях!) 6. Автоматическая идентификация аллельных вариантов. 7. Cтандартизация vs. традиционный электрофорез

Система ккапиллярного электрофореза Буфер Аргоновый лазер 488 нм Анализ результатов Капилляр 50 µm заполненный линейным полимером Буфер Образец в формамиде 5-20 kV 50-60°С Капилляр + -

Внесение образца в капилляр (инжекция) Образец в формамиде + размерный стандарт ДНК - - Электрод Капилляр ДНК - - Пример: Инжекция 3 кВ - 5 секунд Количество вносимой ДНК обратно пропорционально ионной силе раствора –> HIDI Формамид Удаление солей позволяет повысить уровень сигнал.

Разделение фрагментов Капилляры - 50µm, длина 43 см (36 см до детектора) Пористый матрикс – Поли-диметил акриламид (ПДМА) + 8 M мочевина + 5% 2-пирролидон ( Коммерческие полимеры: POP-4, POP-6,POP-7) Буфер: 100 mM TAPS + 1 mM ЭДТА (pH 8.0) TAPS (N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropane-sulfonic acid) не меняет pH при изменении температуры Напряжение: 5-20 kV

Флуоресцентная детекция При поглощении энергии света определенной длины волны происходит возбуждение флуоресцентной молекулы. Это состояние нестабильно. Молекула быстро возвращается в исходное состояние испуская энергию в виде света определенной длины волны. 6FAM (желтый), R6G (оранжевый), TAMRA (красный) 5-меченые праймеры (хранить в темноте!)

FAM (Синий)JOE (Зеленый)TAMRA (Желтый)ROX (Красный) Флуоресцентные красители для праймеров Основание ДНК Краситель 520 нм 548 нм 580 нм 605 нм linker Производители используют разные линкеры

ABI 310 Filter Set F Длина волны (nm) FAM JOENEDROX Возбуждающий лазер (488, nm) Возбуждающий лазер (488, nm) Нормированная интенсивность флуоресценции Спектры испускания красителей

Изображение, снимаемое CCD камерой в 16-капиллярном приборе

Виртуальные фильтры nm Filter A Filter C Filter F Filter G5 FL FAM TET VIC JOE HEX NED TMR PETROXLIZ Используемые красители Filter sets определяет какой регион CCD камеры активен и какая часть видимого света будет регистрироваться Стрелками указаны максимумы испускания красителей

5 x 5 матрикс - ABI 310 6FAM VIC NED PET LIZ Сырые данные с матриксным стандартом Данные после применения матрикса From Identifiler Users Manual До 6 красителей одновременно (до 24 STR маркеров )

Мультиплексная ПЦР – одновременный анализ нескольких маркеров

Анализ мультиплексной реакции GeneMapper (Life Technologies) GeneMarker (…)

Полиморфизмы ДНК выявляемые фрагментным анализом 1. Микросателлиты – STR (Short Tandem Repeat) 2. Однонуклеотидные полиморфизмы - SNP (Single nucleotide polymorfism) 3. Инсерции/делеции - InDels X Y 6 п.н. делеция TCAT Область повторов AGACTAGACATT AGATTAGGCATT

Анализ микросателитных маркеров (STR). AnimalType Pig (BioType, Германия)

Размерный стандарт Размерный стандарт – набор флуоресцентно меченных фрагментов известной длины, стабильной подвижности В диапазоне 100 – 500 п.н. зависимость размера от скорости линейная

Определение относительных размеров фрагментов ДНК Метод Local Southern

Аллельная лестница (лэддер) AnimalType Pig (BioType, Германия) Стандартный набор аллелей В природе аллелей больше

Зачем нужен аллельный лэддер? Аллельный лэддер Форез 1 Генотип: 181,37/185,35 Форез 2 Генотип: 179,52/183,40

Большой мультиплекс не всегда эффективно работает Деградация -> миниSTR

Область STR -повторов miniSTR праймер Обычнй праймер Длиный ПЦР продукт в составе большого мультиплекса MiniSTR miniSTR: принцип Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition, Figure 7.2, ©Elsevier Science/Academic Press ~150 п.н. короче

Влияние количества ДНК -A +A 10 ng избыток матрицы 2 ng оптимальное количество DNA Size (bp) Relative Fluorescence (RFUs) 100 pg 5 pg DNA Size (bp) Оптимум ng при 30 циклах

Избыточное количество ДНК в реакции Повтор ПЦР с нормированным количеством ДНК (1 нк) – полный профиль Избыточное количество ДНК в реакции –> перегруз Матрикс не работает Повторное внесение ДНК с уменьшенной инжекцией –> отсутствие длинных фрагментов

Артефакты ПЦР: Неполное аденилирование -A +A Способы предотвратить неполное аденилирование: 1. Продолжительный прогрев при 68-72°С после завершения программы ПЦР (до 1 часа) 2. Контроль количества вносимой ДНК (не хватает активности полимеразы) 3.«Волшебный хвост» для немеченого праймера с последовательностью, промотирующей аденилирование: 5-G- 5- ATA- 5- GTTTCT- 5- GTGTCTT-

Артефакты ПЦР: Статтеры Статтеры 6.3%6.2%5.4% Аллели GATA CTAT GATA 5 4 C TA T Уровень стартеров зависит от - размера повтора (ди-, три, тетра, пента) - числа повторов - количества циклов

Артефакты: DyeBlob Праймеры плохо очищены После очистки ПЦР-продукта на колонках Необходимо требовать от поставщиков праймеров двойной очистки: ВЭЖХ + ПААГ

Анализ инсерций/делеций - Большой потенциал мультиплексности - Эффективность амплификации выше чем для микро сателлитов -> высокая чувствительность - Отсутствие артефактов ПЦР (стартеров)

Анализ однонуклеотидных замен - SNaPshot

Принцип MLPA