Всеукраїнська науково-практична конференція з міжнародною участю, Пленум Асоціації інфекціоністів України і нарада завідувачів кафедр інфекційних хвороб вищих медичних навчальних закладів III- IV рівнів акредитації ТРУДНОЩІ ДІАГНОСТИКИ І ТЕРАПІЇ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБТРУДНОЩІ ДІАГНОСТИКИ І ТЕРАПІЇ ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ травня 2011 року, м. Суми ГУ Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского НАМНУ ПРОБЛЕМЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА С д. мед. н., проф. А. Л. Гураль д.мед.н. Т.А. Сергеева д. мед. н. В. Р. Шагинян

Вирусом гепатита С инфицированы от 500 млн. до 1 млрд. людей. Фактически, в настоящее время в мире наблюдается пандемия гепатита С, которая по своим масштабам в 5 раз превышает распространение ВИЧ-инфекции У 70-85% инфицированных HCV развивается хронический гепатит – основная клиническая форма этой болезни. Диагноз гепатита С чаще устанавливают на этапе сформировавшегося хронического гепатита или цирроза печени. В последние годы в странах ЕС были предприняты инициативы, направленные на повышение «настороженности» в плане вирусных гепатитов. В 2006 г. в Европейском парламенте было определено, что процесс гармонизации систем надзора за вирусными гепатитами в ЕС – одно из приоритетных направлений деятельности European Centre for Disease Prevention and Control – ECDC. М.С.Балаян, М.И.Михайлов, 2000; J.H. Kao, D.S. Chen, 2002; D. Lavanchy, 2004; J. Alexander, K.V. Kowdley, ; A. Craxi, 2003; A.-M. Giroud-Robert 2004; G.L. Atmstrong et al., ; ECDC, 2008; Р. Marcellin, 2009 ИЭИБ

ИЭИБ Основные проблемы специфической диагностики гепатита С Отсутствие нормативной базы в отношении проведения обследований на специфические маркеры HCV-инфекции различных групп населения; Отсутствие в широкой лабораторной практике (и в первую очередь в службе крови) молекулярно-биологических методов исследования; коммерциализация этой сферы лабораторных услуг; Отсутствие регламентированной унифицированной стратегии специфической диагностики HCV-инфекции и соответствующего алгоритма проведения первичных (скрининговых) и подтверждающих исследований на наличие серологических и генетических маркеров инфицирования в зависимости от целей и задач исследования; Недостаточный охват тестированием различных групп населения.

Основные контингенты, подлежащие регламентированным обследованиям ВИЧ- инфекция Гепатит В Гепатит С Доноры крови, органов, тканей, клеток и др. Беременные Реципиенты крови и ее компонентов Медицинские работники с профессиональным риском Пациенты с высоким риском инфицирования Больные с хроническими поражениями печени Дети детских домов и специнтернатов Лица с ИППП Потребители инъекционных наркотиков Лица с рискованным сексуальным поведением Лица, имевшие сексуальные контакты с инфицированными Призывники Дети, рожденные инфицированными матерями Лица, находящиеся в местах лишения свободы Лица, обследующиеся с профилактической целью (здоровые) Обследования по клиническим показаниям Обследования по эпидемическим показаниям ИЭИБ Нормативная база в отношении проведения специфических обследований на маркеры инфицирования HCV ограничивается Приказом МЗ Украины 106 «Про обстеження донорів на гепатит С» (1994), 385 «Про інфекційну безпеку донорської крові та її компонентів» (2005) и Приказом Минобороны Украины 402 (2008)

ИЭИБ Результаты обследований на серологические маркеры гепатита С некоторых групп населения в гг. (ЦСЭС) Контингенты обследованных лиц nАнти-HCVn Больные острым вирусным гепатитом / 19,6% / 18,3% Больные с хроническими заболеваниями печени / 17,0% / 14,3% Больные с заболеваниями ЖКТ / 8,3% / 7,0% Другие больные / 14,2% / 12,1% Контактные лица / 4,8% / 10,9% Переболевшие вирусными гепатитами / 19,2% / 17,6% Беременные / 3,6% / 2,6% Дети детских домов и специнтернатов / 6,2% / 7,6% Медработники / 4,1% / 3,7% Больные, длительно находившиеся на стационарном лечении / 11,5% / 10,8% Больные наркодиспансеров / 35,4% / 36,2% Больные вензаболеваниями / 13,2% / 8,0% Всего проведено исследований / 5,9% / 4,8% В 2008 г. официально зарегистрировано 873 случая острого ГС, В 2009 г. – 964, в 2010 г. – 786 случаев

ИЭИБ Распространение гепатита С в различных группах населения Распространение гепатита С в различных группах населения А.Л. Гураль, В.Ф. Мариевский, ; Т.А. Сергеева, 2008; О.Н. Рубан, 2010 Группы обследованныхN Выявлены анти-HCV Абс.% ± m p Группы медицинского риска Пациенты неинфекционных ЛПУ, * в том числе: ,0 ± 0,4 - с хроническими заболеваниями печени ,4 ± 1,6 - с хроническими заболеваниями желчных путей и поджелудочной железы ,6 ± 1,0 Медицинские работники ,3 ± 0,4 Группы поведенческого риска Инъекционные потребители наркотиков ,5 ± 1,3 ВИЧ-инфицированные лица ,3 ± 1,4 Работники коммерческого секса ,8 ± 1,2 Лица с инфекциями, передаваемыми половым путем, ,9 ± 0,9 * в том числе: больные сифилисом ,0 ± 4,1 Группы сравнения Доноры крови ,3 ± 0,3 Беременные ,1 ± 0,6

The disease iceberg for Hepatitis C ( The disease iceberg for Hepatitis C (J. Parkes, P. Roderick, B. Bennett-Lloyd, and W. Rosenberg, BMC Public Health. 2006) Anti-viral treatment Eligible for treatment Attend specialist service Referred to specialist service Positive HCV test Untested & unknown to services ИЭИБ

ИЭИБ Специфические лабораторные обследования Диагностические исследования направлены на установление и/или верификацию диагноза; их необходимо осуществлять при подозрении (или с целью исключения) острого или хронического инфекционного процесса гепатита В и гепатита С. Обследования по эпидемическим показаниям направлены на расследование вспышек, оценку эффективности противоэпидемических и профилактических мероприятий, проводятся с целью сероэпидемиологических исследований. Эпидемическими показаниями также являются: возникновение единичных или групповых заболеваний в ЛПУ, детских дошкольных, специализированных заведениях, других организованных коллективах, в семейных очагах инфекции, в окружении больных острыми или хроническими вирусными гепатитами, вирусоносителей; при возможном профессиональном инфицировании и в ряде других случаев. Профилактические обследования должны распространяться на определенные группы лиц, к числу которых относятся: доноры крови, костного мозга, органов и тканей; беременные; медицинские работники и целый ряд других контингентов. Целевые обследования, направленные на обеспечение потребностей дозорного эпидемиологического надзора, который основывается на систематическом сборе и анализе данных об особенностях развития эпидемического процесса в выборочных группах населения (дозорных, целевых, фокусных) с целью раннего выявления случаев заболевания в группах риска или же для получения индикаторных показателей в отношении тенденций развития эпидемического процесса в конкретных популяциях.

ИЭИБ Контингенты обследуемых лиц / цели обследования ДиагностическиеПо эпидпоказаниямПрофилактические - Больные с патологией гепатобилиарной системы; - Дети, рожденные инфицированными матерями; - Пациенты с патологией, которая может указывать на внепеченочные проявления вирусных гепатитов; - Лица, у которых наблюдалось повышение активности аминотрансфераз и любого происхождения и др. - При вспышках, единичных или групповых заболеваниях ВГ; - Лица в окружении больных острыми, хроническими ВГ, вирусоносителей - Доноры, беременные; - Исследования при определении напряженности иммунитета против ГВ. - Доноры и реципиенты инфицированной крови; - Медицинские работники; - Дети и персонал специализированных учреждений; - Лица с высоким медицинским риском инфицирования HBV и HCV; - Персонал и спецконтингенты учреждений пенитенциарной системы и др. - Больные, госпитализированные в отделения гемодиализа; пациенты, подвергающиеся частым трансфузиям крови и / или ее препаратов, курсам инъекционной терапии; длительно и часто болеющие; - Пациенты с врожденными или приобретенными иммунодефицитами любого генеза; - Пациенты кожно-венерологических диспансеров; - Больные туберкулезом, онкологическими заболеваниями, с хроническими поражениями различных органов и систем; - Лица, когда-либо употреблявшие внутривенные формы наркотиков и др. группы риска.

ИЭИБ Специфическая диагностика гепатита С - - выявление диагностических маркеров инфицирования: антигенов, антител, генетического материала вируса с помощью современных серологических и молекулярно-биологических методов исследования. Методы выявления маркеров инфицирования HCV Прямые Непрямые Молекулярно-биологическиеСерологические РНК HCV Антитела, антигены HCV

ИЭИБ Серологические методы исследования применяются как при первичном скрининге, так и в диагностике HCV-инфекции. - применяются как при первичном скрининге, так и в диагностике HCV-инфекции. Первичные скрининговые тесты (главным образом, ИФА); Первичные скрининговые тесты (главным образом, ИФА); Дополнительные аналитические тесты (ИБ); Дополнительные аналитические тесты (ИБ); Исследования, направленные на серологическое определение генотипа вируса («серотипирование»). Исследования, направленные на серологическое определение генотипа вируса («серотипирование»). При остром гепатите С специфические антитела могут быть определены у % пациентов в начале симптоматической фазы. В среднем, сероконверсия определяется в сроки от 8 до 12 недель от момента инфицирования, (это время может варьировать от 5 до 50 недель). Промежуток времени, предшествующий сероконверсии – период «окна» (серонегативное, латентное, инфекционное, диагностическое окно).

ИЭИБ Возможные причины ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов выявления анти-HCV: Ложно-положительные Ложно-положительные: Неспецифическое связывание иммуноглобулинов сыворотки крови с компонентами иммуносорбента тест- системы; Повышенный уровень гамма-глобулина в сыворотке (у больных с ревматизмом, некоторыми злокачественными заболеваниями и т. п.); Аутоиммунные заболевания, заболевания соединительной ткани; Некоторые инфекционные болезни (гепатит В, туберкулез и др.); Следствие иммунизации; беременность и др. Проведение исследования в популяции с низкой распространенностью HCV-инфекции. Ложно-отрицательные Ложно-отрицательные: У лиц с иммуносупрессией (у ВИЧ- инфицированных, реципиентов трансплантатов солидных органов, при гипо- и агаммаглобулинемии, у пациентов, находящихся на гемодиализе. Пациенты амбулаторно-поликлинического отделения 0,6% Беременные 1,4% Медицинские работники 1,6% ВИЧ-инфицированные лица 1,6% Потребители инъекционных наркотиков 2,5% Пациенты кожно-венерологического диспансера 2,7% Пациенты гастроэнтерологических отделений 2,8% Онкологические больные 5,4% Больные на гемодиализе 6,2% Частота ложно-положительных результатов при выявлении анти-HCV среди различных групп обследованных лиц

ИЭИБ Конфирматорные подходы, подтверждающие присутствие анти-HCV Повторное тестирование реактивных образцов в той же самой тест- системе ИФА Перестановка позитивного образца в другом, альтернативном тесте ИФА Исследование методом ИБ Определение антител к отдельным белкам вируса в формате ИФА NAT тесты для выявления РНК ВГС (но они не могут рассматриваться как истинно конфирматорные тесты) В идеале, все первично реактивные образцы необходимо повторно исследовать при помощи более специфичных тестов. Верификация присутствия анти-HCV минимизирует ненужные посещения медицинских учреждений и психологическую травму для людей с ложно-положительными результатами тестирования

СЕ1 E2/NS1 NS2NS3NS4NS5 C22 gp36 gp70 C200 C33 C100 NS СХЕМА ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА ВИРУСА ГЕПАТИТА С ИЭИБ

Благоприятные и неблагоприятные признаки выявления антител к структурным и неструктурным белкам HCV Благоприятные признаки Анти-HCV core IgM Отсутствие в сыворотке после 1-го мес. болезни Анти-NS4 IgMИсчезновение после 7-го мес.; низкий уровень через 1 мес. Анти-NS5 IgMОтсутствие в сыворотке Анти-HCV core IgG Быстрое нарастание уровня в течение первых 72 дней с максимальным показателем в период дней и последующий спад до полного исчезновения до мес. Анти-NS4 IgGСнижение уровня через 8 мес. или раньше Анти-NS5 IgGМинимальный уровень, особенно после 1 мес. болезни Неблагоприятные признаки Анти-HCV core IgM Присутствие в сыворотке после 1 мес. болезни Анти-NS4 IgM Появление после 7 мес. болезни; относительно высокий уровень после 1 мес. Анти-NS5 IgMПрисутствие в сыворотке крови Анти-HCV core IgG Постепенное нарастание уровня в течение первых 6-7 мес. инфекционного процесса и быстрое нарастание концентрации после 6-7 мес. с достижением максимальных значений к 8-12 мес. Анти-NS4 IgGПрисутствие в сыворотке после 8 мес. болезни Анти-NS5 IgGВысокий и относительно высокий уровень ИЭИБ

ИЭИБ Варианты интерпретации результатов выявления антител к ВГС Анти-HCV (суммарные) Острый гепатит С Хронический гепатит С паст-инфекция Анти-HCV core IgM + Анти-HCV core IgG Острый гепатит С Переход в латентную фазу хронического ГС Анти-HCV core IgG + антитела к неструктурным белкам Начало выздоровления Латентная фаза хронического ГС Анти-HCV core IgM + Анти-HCV core IgG + антитела к неструктурным белкам Острый гепатит С Обострение в латентную фазу хронического ГС Реактивация хронического гепатита С Корреляция между присутствием анти-HCV core IgМ и обнаружением РНК вируса в сыворотке крови и составляет от 77 % до 92 %. Анти-HCV core IgМ обнаруживаются в сыворотке крови % пациентов с острым и % больных хроническим гепатитом С. Присутствие анти-NS3, анти-NS4, анти-NS5 коррелирует с наличием вирусной РНК. Антитела к антигенам NS4 могут свидетельствовать о перенесенной инфекции; косвенно подтверждать активность репликации ВГС при хроническом гепатите С; свидетельствовать о начале хронизации процесса у больных острым ГС.

ИЭИБ Молекулярно-биологические методы диагностики Качественные методы выявления РНК Количественные методы выявления РНК Методы генотипирования и выявления мутаций HCV РНК может быть определена через 2 недели от момента инфицирования HCV Ранняя и эффективная диагностикаРанняя и эффективная диагностика Подтверждение результатов скринингаПодтверждение результатов скрининга Прогноз течения и исходов заболеванияПрогноз течения и исходов заболевания Определение показаний к терапииОпределение показаний к терапии Выбор оптимальной тактики леченияВыбор оптимальной тактики лечения Предсказание эффективности специфической терапииПредсказание эффективности специфической терапии Мониторинг эффективности терапииМониторинг эффективности терапии Оценка устойчивости ответа на терапиюОценка устойчивости ответа на терапию

ИЭИБ Возможные причины ложных результатов выявления РНК HCV Утрата или разрушение нуклеиновых кислот вируса во время подготовки образцов; Наличие в исследуемом материале различных химических или белковых субстанций, которые могут служить ингибиторами для отдельных компонентов ПЦР; Концентрация НК у обследуемого лица может быть ниже предела чувствительности используемого метода и т.д.; Контаминация: между пробами, положительным контрольным образцом, ампликонами; Оккультная HCV-инфекция. Оккультная HCV-инфекция – присутствие РНК HCV на уровнях, которые повторно не обнаруживаются в сыворотке или плазме крови при текущих клинико-лабораторных исследованиях, но обнаруживаются в мононуклеарах периферической крови и / или тканях печени с помощью молекулярных методов исследования более высокой чувствительности. В большинстве случаев состояние оккультного гепатита С сопровождается наличием анти-HCV (вместе с тем, отсутствие этих антител не исключает оккультную инфекцию). Pham TNQ, MacParland SA, Mulrooney PM et al., 2004; Radkowski M, Gallegos-Orozco JF, Jablonska J et al., 2005; Castillo I, Rodriguez-Inigo E, Lopez-Alcorocho JM, Pardo M, 2006; Pham TNQ, Mulrooney-Cousins PM, Mercer SE et al., 2007; Blackard JT, Kemmer N, Sherman KE, 2006

ИЭИБ Интерпретация результатов исследования Анти- HCV РНК HCV Интерпретация ++ Острая или хроническая HCV-инфекция, в зависимости от клинических проявлений. +- Разрешение HCV-инфекции; острая HCV-инфекция в период низкой виремии или транзиторного клиренса; хронический гепатит С с флуктуациями уровня РНК; ингибиция РНК вируса вследствие различных причин; уровень РНК у обследуемого лица ниже порога чувствительности примененного метода; ложно- положительный результат ИФА; ложноотрицательный результат ПЦР; оккультная HCV-инфекция. -+ Ранний период острой HCV-инфекции (период «серонегативного окна»); хроническая HCV- инфекция у пациентов с иммунодефицитом; инфицирование «редкими» генотипами HCV; ложно- отрицательный результат ИФА; ложно- положительный результат на РНК HCV -- Отсутствие HCV-инфекции

ИЭИБ Диагностическая значимость специфических маркеров инфицирования ВГС (М.И.Михайлов, 2001) Маркер Скрининг в службе крови Подтвер- ждение резуль- татов Диагно- стика Мониторинг терапии Прогноз эффекти- вности терапии Эпидемио- ологичес- кие иссле- дования Анти-HCV +++ Спектр (антитела к отдельным белкам HCV) ++++ Анти-HCV core IgM ++++ Анти-HCV core IgG РНК HCV РНК HCV количество ++ Генотип ++ Серотип ++

ИЭИБ 1. Предварительная оценка степень риска инфицирования пациента. 2. Первоначально показано исследование на наличие анти-HCV. 3. Определение HCV RNA рекомендуется: а) позитивный результат ИФА на анти-HCV; б) планирование противовирусная терапии (количественная ПЦР для определения исходного значения вирусной нагрузки); в) при иммуносупрессии, признаках заболевания печени, подозрении на острый гепатит С и негативных результатах обнаружения анти-HCV 4. Определение генотипа HCV – всем пациентам до начала противовирусной терапии (для выбора дозы препаратов, длительности лечения и оценки ожидаемой эффективности). Примерный алгоритм тестирования ИФА на анти-HCV -+ Подтверждающее исследование - + Повторное исследование

ИЭИБ «… Если же сюда добавить и все те хронические состояния здоровья и ограничения трудоспособности, которые являются последствиями перенесенных острых инфекционных болезней, то удельный вес отрицательного значения инфекционной заболеваемости еще более возрастет...» Громашевский Л.В. От обороны к нападению // На фронте здравоохранения. – – 22. – С

ИЭИБ Спасибо за внимание ! д.мед.н., проф. А.Л. Гураль, д.мед.н. Т.А. Сергеева, д.мед.н. В.Р. Шагинян лаборатория эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции ГУ Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В Громашевского АМН Украины 03680, ул. Н. Амосова, 5, г. Киев; тел./факс: (044)