ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ Цаур Г.А Центр детской онкологии и гематологии Областная детская клиническая больница 1 Екатеринбург

Молекулярно-генетические методы Полимеразная цепная реакция (PCR) Методика разветвленных зондов (branched DNA) Транскрипционно-опосредованная амплификация Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) Амплификация с вытеснением цепи (SDA) Гибридный захват (HC) Лигазная цепная реакция (LCR) Другие... QB репликаза, Биочипы

Молекулярно-генетические методы Ломают границы между традиционными лабораторными технологиями Клиническая химия Гематология Микробиология Вирусология Генетика

Kary B. Mullis Saiki R, Scharf S., Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science Dec 20;230(4732):

Схема ПЦР

ПЦР в реальном времени метка гаситель праймер матрица полимераза флуоресценция полимераза А.В.Мисюрин

ПЦР в реальном времени Пороговое значение Пороговый цикл

10 7 копий 10 5 копий 10 6 копий

Сравнение результатов ПЦР и ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени HCV Количество геномных эквивалентов / мл Качественное определение HCV

Преимущества ПЦР в реальном времени 1. Повышение специфичности метода за счет наличия зонда ; 2. Возможность количественного определения; 3. Автоматизация; 4. Снижение риска контаминации за счет отсутствия электрофореза ; 5. Снижение времени проведения реакции; 6. Уменьшение площади, занимаемой ПЦР- лабораторией

Относительно просты в исполнении Зачем использовать ПЦР? Высокая чувствительность Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами Не существует альтернативных методов диагностики Эффективны для мониторинга эффективности лечения

Относительно просты в исполнении требует высокой квалификации персонала Оборотная сторона Высокая чувствительность существует потенциальная опасность ложно+ результатов (контаминации) Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами но часто необходимы дополнительные методы верификации Не существует альтернативных методов диагностики Эффективны для мониторинга эффективности лечения

Направления применения ПЦР Инфекционная микробиология / Санитарная эпидемиология Диагностика и мониторинг терапии онкологических и онкогематологических заболеваний Наследственные заболевания Тестирование на наличие генетически- модифицированных компонентов в продуктах питания Фармакогеномика HLA-типирование

Революция в диагностике инфекционных заболевания Быстрое и точное определение возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, в т.ч.некультивируемых и медленно растущих Терапевтический мониторинг эффективности лечения при вирусных заболеваниях Определение устойчивости к антибиотикам Открытие и идентификация новых вирусов Эпидемиологические исследования (особенно для социально значимых инфекций) Выработка стратегии по контролю инфекционных заболеваний

Молекулярная микробиология HIV-1 & 2 HCV HBV EBV CMV HSV 1, 2, 6 типов VZV HPV JC & BK вирусы Энтеровирусы Риновирус Аденовирус РС-вирус Метапневмовирус Вирус Лихорадки Западного Нила Вирус гриппа Вирусы парагриппа SARS Парвовирус B19 HAV Toxoplasma Legionella Chlamydia N. Gonorrhoeae Mycobacterium spp. Mycoplasma & Ureaplasma Bordetella Helicobacter pylori MRSA Candida И другие

Острый лимфобластный лейкоз T-ALLPro-B Pre-B / common Pre-BB-ALL Del 1p32 SIL / TAL t(4;11) MLL / AF4 t(9;22) BCR / ABL t(11;19) MLL / ENL t(8;14) MYC / IgH t(12;21) TEL / AML1 t(1;19) E2A / PBX СОЗРЕВАНИЕ B-клеток

Острый миелобластный лейкоз ОМЛ М2ОМЛ M3ОМЛ М4ОМЛ M5ОМЛ М7 t(8;21) AML / ETO t(15;17) PML / RARa inv16 CBFb / MYH11 t(1;22) t(9;11) MLL / AF9 WT-1, NPM1, FLT3

Солидные опухоли ГенЗаболевание RB1Ретинобластома MYCNНейробластома CDKN2AМеланома ATMАтаксия-телеангиэктазия BRCA Наследственные форма рака молочной железы APCНаследственный полипоз кишечника

Факторы прогноза ГенЗаболеваниеПрогноз BCR / ABLОЛЛ TEL / AMLОЛЛ PML / RARaОМЛ М3 MYCNНейробластома SPARCМенингиома

Оценка эффективности терапии(МРБ) ГенЗаболевание IgHОЛЛ TCRОЛЛ Ген тирозингидролазыНейробластома СК19Рак молочной железы СК20Рак желудка Ген кодирующий PSAРак простаты FLI1 / EWSСаркома Юинга

Мониторинг количества химерного гена MLL-AF4 (МРБ) Пациент A.K., КМПациент А.Г, КМ Динамика снижения MLL - AF4 в костном мозге и периферической крови Стандартная кривая для плазмиды MLL - AF 4 Slope Y-Intercept

Клонирование генов создание трансгенных животных, генетически модифицированных растений (1) ДНК организма А, упакованная в хромосомы. (2) ПЦР. (3) Множество копий 1 гена из организма A. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида со встроенным геном из организма А. (6) Вставка плазмиды в организм B. (7) Увеличение числа копий гена организма А в организме B.

Тестирование на наличие генетически- модифицированных ингредиентов Соя линия Кукуруза линия GA-21 (терминатор Nos) линия MON 810

Наследственные заболевания Муковисцидоз - 7 мажорных мутаций гена CFTR ( F508, G17173A, G542X, R553X, 3905 insertion T, W1282X, N1303K) Миодистрофия Дюшенна Гемофилия А и В - более 100 мутаций Болезнь Вильсона-Коновалова - 70 мутаций в гене БВК, наиболее часто His1069Gln Гемохроматоз ( C282Y, H63D )

Направления применения ПЦР Идентификация личности (+отцовство) «геномная дактилоскопия» Исследование эволюционной теории Электрофорез амплифицированных в ходе ПЦР фрагментов ДНК (1)Отец. (2) Ребенок. (3) Мать. У ребенка есть часть генов от каждого из родителей. И это дает новую уникальную комбинацию

Геномная дактилоскопия

Фармакогеномика Субстраты для CYP2D6 и CYP2C19

Фармакогеномика для индивидуализирования терапии Высокий риск токсических эффектов Предположительно, ответят на терапию Лечение альтернативными дозами препаратов Предположи тельно, не ответят на терапию Лечение обычными дозами препаратов

1.Подбор пары донор-реципиент при трансплантации 2.Определение предрасположенности к заболеваниям: -Сахарный диабет I типа -Целиакия -Анкилозирующий спондилоартрит -Ревматоидный артрит HLA-типирование H uman L eukocyte A ntigens HLA-антиген II класса HLA-антиген I класса

HLA-типирование ПЦР-SSP ПЦР-SSO Секвенирующее типирование

HLA-типирование. ПЦР-SSP

Совместимость по системе HLA для ТГСК ЛокусРекомендации HLA-A Да HLA-B Да HLA-C Да HLA-DRB1 Да DRB3, 4 и 5 Не известно HLA-DQA1 и B1 Не ясно HLA-DPA1 и B1 Не ясно National Marrow Donor Program, NMDP USA (2004)

Принцип подбора доноров: отличия HLA-типирования «низкого» и «высокого» разрешения J.M. Tiercy, Prague, 2007

Контроль качества Преаналитический этап ПроцедураУсловия Взятие образцаВ закрытые системы, свободные от ДНКаз, РНКаз Транспортировка Максимально быстро. Оптимально при +4 С Хранение Для исследования РНК – С. Не допускать повторное замораживание не допустимо В.В. Меньшиков Клиническая лабораторная диагностика, 2006, 3

Оценка качества РНК Свежий материал RIN 8.3 Хранение 1 день, комнатная температура Транспортировка 2 дня, комнатная температура Транспортировка 4 дня, комнатная температура

Чувствительность метода Теоретическая Реальная (на примере MLL-AF4 протокол EAC) Костный мозг 5*10 -4 – 6*10 -5 Кровь 1*10 -4 – 7*10 -4

Различия в стандартах Slope Y-Intercept Slope Y-Intercept Плазмиды b2m Ipsogen копий копий Плазмиды b2m другой производитель

Программа контроля качества EQUAL Одинаковые праймеры и зонды Одинаковые разведения стандартной кДНК Одинаковые образцы крови с неизвестной концентрацией Разная химия (полимераза, обратная транскрипция для неизвестных образцов) Разные приборы для ПЦР в реальном времени

Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, кДНК 5,526 *10 1 копий гена ABL min 2,569*10 1 max 541,170*10 1

Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006 Образец крови с неизвестным количеством копий гена ABL Min 0,180*10 4 mean 5,632*10 4 max 21,284*

Программа контроля качества GLEEM T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007 К562 – клеточная линия, несущая химерный ген BCR / ABL, характерный для ХМЛ

Обязательно типировать образцы в повторах (в идеале в триплетах), особенно при низкой концентрации исследуемого гена-мишени T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

Воспроизводимость по гену b2m. Образцы от пациентов с неизвестной концентрацией Число копий Образцы пациентов, протестированные в 5 разных постановках в триплетах 1234 Mean 35,7* ,2*10 5 8,3*10 5 0,8*10 5 SD 7,1*10 5 1,1*10 5 1,4*10 5 0,3*10 5 CV, % 20,007,4117,0240,53

Воспроизводимость Ct b2m Концентрация плазмид Ct 1,00E+071,00E+061,00E+05 Mean 14,1517,4820,73 SD 0,510,670,62 CV, % 2,513,471,75

Различия в приборном парке Амплификация

Различия в приборном парке M Silvy et al Leukemia (2005) 19, 305–307

Благодарю за внимание!