ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Вус Екатерина Александровна Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина Научный руководитель: доктор физ.- мат. наук, проф. Горбенко Галина Петровна

Зависимость от рН, ионной силы раствора, связывание с «лишними» объектами «конструирование» Экспериме- нтальная проверка Поиск новых зондов Актуальность Метод флуоресцентных зондов Недостатки имеющихся красителей: низкая чувствительность токсичность фотонеустойчивость «плохая» спектральная область флуоресценции Бензантроновые и тиазоловые (полиме- тиновые) зонды липофильность большие «стоксовы сдвиги» и коэффициенты экстинкции чувствительность к полярности и вязкости среды Биологические объекты: клеточные мембраны, ДНК, белки и их конформационные изменения : фибриллярные и префибриллярные агрегаты нейродегенеративные болезни нейродегенеративные болезни

Цель работы Изучение взаимодействий новых флуорофоров – полиметиновых и бензантроновых красителей с фибриллярными и префибриллярными агрегатами лизоцима, а также с модельными мембранами клетки – липосомами, с целью получения качественных флуоресцентных маркеров этих биообъектов

Зрелые фибриллы – высокоупорядоченные агрегаты с центральной поперечной бета- слоистой структурой, в которой бета- складки лежат перпендикулярно оси фибриллы, а бета-слои – вдоль ее направления. Зрелые фибриллы имеют диаметр 3 – 12 нм и состоят из 2 – 6 закрученных протофиламентов, имеющих диаметр 2 – 5 нм Объекты исследования. I. Aмилоидный лизоцим и модельные плазматические мембраны Микрофотография фибрилл лизоцима. Микрофотография фибрилл лизоцима. Инкубация белка в 80% этаноле в течении 30 дней по методу Холли Гидрофобный хвост Полярная головка 4.6 нм Вода Липосомы – униламеллярные везикулы диаметром 100 нм, состоящие из смесей ФХ с КЛ и ХОЛ, были получены методом экструзии. Эти везикулы – модельные мембраны клеток Структура липосомы

II. Новые флуорофоры С1 Бензотиазол А. Цианиновые зондыОбладают высокими коэффициентами экстинкции (3800 – 9300 M –1 cм –1 ), поглощением при 453–519 нм и излучением в длинноволновой области спектра, т. е. не пересекается с флуоресценцией биообъектов (УФ-область). Удлине- ние полиметиновой цепи позволяет конструировать зонды с разной областью флуоре- сценции, т. к. сдвигает максимум поглощения вдлинноволновую область. Зонды являются производными Тиозолового Оранжевого, содержащие ациаминозамести- тели в бензотиазоловой части. А. Цианиновые зонды. Обладают высокими коэффициентами экстинкции (3800 – 9300 M –1 cм –1 ), поглощением при 453–519 нм и излучением в длинноволновой области спектра, т. е. не пересекается с флуоресценцией биообъектов (УФ-область). Удлине- ние полиметиновой цепи позволяет конструировать зонды с разной областью флуоре- сценции, т. к. сдвигает максимум поглощения вдлинноволновую область. Зонды являются производными Тиозолового Оранжевого, содержащие ациаминозамести- тели в бензотиазоловой части. С4 С16 С8 С6

Б. Бензантроновые зонды. Обладают высокими коэффициентами экстинкции и флуоресценцией в области 500 – 700 нм, большим стоксовым сдвигом. Чувствительны к полярности и вязкости окружения. Не флуоресцируют в буфере, а только в неполярной среде. Производные бромобензантрона, синтезированные нуклеофильным замещени- ем атома брома в 3-бромобензантрона Бромобензантрон А4 А6 А8 АМ1 АМ3 АМ2 АМ4

Этапы работы. Анализ распределения зонда С1 между мембранной и водной фазами в липосомах различного состава Зависимости изменений интенсивности флуоресценции от концентрации липида. ФХ – фосфатидилхолин, КЛ – кардиолипин, ХОЛ - холестерин Концентрация липида, мкМ

Анализ распределения зонда между мембранной и водной фазами Коэффициент распределения ( К р ) и молярная флуоресценция ( а ) Кр Кр характеризуют взаимодействие зонда с мембранами. Поиск Кр осуществляется аппроксимацией функции: Δ I max - предельная интенсивность флуоресценции, [L] - концентрация липида, γ - общий объем липидной фракции в мембране [Z] - общая концентрация флуоресцентного зонда а а характеризуют квантовый выход зонда в среде. Поиск а осуществляется из уравнения:

+Особенности строения зонда = Модель встраивания красителя в мембраны Ψ Li - поверхностный потенциал, К р L0 и К р Li - Ψ Li - поверхностный потенциал, К р L0 и К р Li - коэффициенты распре- деления зонда в ФХ, ФХ/КЛ и ФХ/ХОЛ липосо- мах, соответственно, Z dye =1 – заряд красителя Поверхностный потенциал мембраны ФХ КЛ Спектральные параметры связывания липосом с С1 зондом Система Коэффициент распределения Молярная флуоресценция, μМ - 1 ФХ (4.9 ± 2.3) ФХ/КЛ(5%) (7.5 ± 1.1) ФХ/КЛ(10%) (20.2 ± 5.1) ФХ/ХОЛ(30%)(3.7 ± 1.1) С1 лучше всего проникает в ФХ/КЛ(10%) липосомы, его молярная флуорес- ценция в ФХ ХОЛ(30%) липосомах.С1 лучше всего проникает в ФХ/КЛ(10%) липосомы, его молярная флуорес- ценция в ФХ ХОЛ(30%) липосомах. Коэффициенты распределения С1 в липосомы различного состава достаточно большиеКоэффициенты распределения С1 в липосомы различного состава достаточно большие

II. Титрование отрицательно заряженными липосомами ФХ/КЛ(10%) цианиновх зондов С4, С6, С8, С16 III. Титрование нативным лизоцимом зондов С4, С6, С8, С16, связанных с мембранами ФХ/КЛ(10%) Высокие значения коэффициентов распределения хорошее связыванииеВысокие значения коэффициентов распределения хорошее связываниие Катионных зондов с отрицательно заряженными модельними мембранами ФХ/КЛ(10%). По сравнению с зондом С1 эти параметры выше в 5-6 раз По возрастанию коэффициента распределения зонды выстроились в ряд: С6По возрастанию коэффициента распределения зонды выстроились в ряд: С6 С8 С16 С4 С1 С8 С16 С4 С1 По возрастанию молярной флуоресценции ряд следующий: С8 С4 С6По возрастанию молярной флуоресценции ряд следующий: С8 С4 С6 С1 С16 где I VV – вертикально поляризованные возбуждение и излучение, I VH - вертикально / горизонтально поляризованное возбуждение / излучение Формула для вычисления анизотропии Измеряли анизотропию флуоресценции красителей в каждой точке титрования

Правильно характеризует мембрану зонд С8, показывающий увеличение анизотропии (R) на 10 % увеличение вязкости микроокружения Зависимость анизотропии флуоресценции зондов от концентрации лизоцима

IV. Изучение связывания полиметинового зонда С1, про- изводных бромобензантрона с фибриллами, префибриллярными агрегатами и нативным лизоцимом Спектры флуоресценции зонда АМ1 (0.3 мкМ) при титровании красителем фибрилл лизоцима Z 0 – общая концентрация зонда, K a – константа ассоциации, n – стехиоме- трия связывания, С р – концентрация белка, a – молярная флуоресценция связанного зонда Модель Ленгмюра Аппроксимация уравнения в Math- cad параметры связывания

Изотермы связывания бензантроновых зондов с фибриллами лизоцима Параметры связывания зондов бензантронового ряда с фибриллами лизоцима ЗондA4A6A8AM1AM2AM3AM4 K a, мкM ± ± ± ± 1033 ± 521 ± ± 0.3 n, моль/ моль 0.05 ± ± ± ± ± ± ± 0.03 α, мкM ± 9220 ± ± ± ± 5390 ± ± 47

По увеличению сродства к фибриллам зонды образуют ряд: А8 АМ4 А6 А4 АМ3 АМ2 АМ1 С1 По увеличению сродства к фибриллам зонды образуют ряд: А8 АМ4 А6 А4 АМ3 АМ2 АМ1 С1 По возрастанию квантового выхода в присутствии фибрилл: С1 А4 АМ3 А8 А6 АМ2 АМ4 АМ1 По возрастанию квантового выхода в присутствии фибрилл: С1 А4 АМ3 А8 А6 АМ2 АМ4 АМ1 АМ1 - лучший для фибрилл за счет K а и a, больших, чем у Тиофлавина Т (ThT). Стехиометрия n, т. е. число мест связывания на молекуле белка у всех зондов одинакова АМ1 - лучший для фибрилл за счет K а и a, больших, чем у Тиофлавина Т (ThT). Стехиометрия n, т. е. число мест связывания на молекуле белка у всех зондов одинакова По увеличению сродства к олигомерам зонды образуют ряд: АМ2 А6 А8 АМ4 А4 АМ1 АМ3 По увеличению сродства к олигомерам зонды образуют ряд: АМ2 А6 А8 АМ4 А4 АМ1 АМ3 По возрастанию квантового выхода в присутствии фибрилл: АМ2 А4 А8 АМ3 А6 АМ1 АМ4 По возрастанию квантового выхода в присутствии фибрилл: АМ2 А4 А8 АМ3 А6 АМ1 АМ4 Лучший зонд для детекции олигомеров - АМ4. К нативному белку сродство всех зондов, меньше на порядок, кроме А6, имеющего большее сродство Лучший зонд для детекции олигомеров - АМ4. К нативному белку сродство всех зондов, меньше на порядок, кроме А6, имеющего большее сродство Параметры связывания зондов бензантронового ряда с олигомерами лизоцима ЗондA4A4A6A6A8A8AM1AM2AM3AM4 K a, мкM ± ± ± ± ± ± ± 0.41 n, моль/ моль 0.02 ± ± ± ± ± ± ± 0.3 α, мкM ± ± ± ± 3640 ± 6175 ± ± 75

Все полиметиновые красители показали высокое сродство к модельным клеточным мембранам, особенно содержащим отрицательно заряженный кардиолипин. Лучшим в этом смысле оказался зонд С1, для которого построена модель встраивания в липосомы. Лучшим для характеристики белок-липидного взаимодействия оказался зонд С8Все полиметиновые красители показали высокое сродство к модельным клеточным мембранам, особенно содержащим отрицательно заряженный кардиолипин. Лучшим в этом смысле оказался зонд С1, для которого построена модель встраивания в липосомы. Лучшим для характеристики белок-липидного взаимодействия оказался зонд С8 Большинство производных бензантрона показали хорошее связывание с фибриллами и префибриллярными агрегатами лизоцима. Для фибрилл лучшим оказался зонд АМ1, для олигомеров – АМ4. Параметры АМ1 оказались даже лучше, чем у классического амилоидного маркера – Тиофлавина Т. К нативному лизоциму имеет хорошее сродство только зонд А6Большинство производных бензантрона показали хорошее связывание с фибриллами и префибриллярными агрегатами лизоцима. Для фибрилл лучшим оказался зонд АМ1, для олигомеров – АМ4. Параметры АМ1 оказались даже лучше, чем у классического амилоидного маркера – Тиофлавина Т. К нативному лизоциму имеет хорошее сродство только зонд А6 Полученные знания о новых флуорофорах позволяют расширить область применения этих красителей Выводы