Лабораторные тесты в оценке нарушений гемостаза Гильманов Александр Жанович проф., д.м.н. Кафедра лабораторной диагностики Института последипломного образования Башкирский медицинский университет, г. Уфа

При наличии клинических проявлений - диагнос- тика, определение причин нарушений гемостаза Перед инвазивной процедурой (операция и др.) – оценка риска кровотечения или тромбоза Контроль лечения препаратами, влияющими на гемостаз (антикоагулянты прямого и непрямого действия, тромболитические и антиТЦ препараты, ингибиторы протеаз…) Цели исследования гемостаза Очень важен клинический этап - определение склон- ности к геморрагиям или тромбозам.

Преаналитический этап исследования гемостаза Исследование ТЦ гемостаза: за день до сдачи крови избегать стрессов, физических нагрузок, смены режима дня, изменений в питании, приема алкоголя. Максимально аккуратная венепункция, жгут – не более 1 мин ! Стараться не брать кровь из внутривенного катетера ! Взятую кровь в закрытой пробирке как можно быстрее обработать для получения плазмы (1 ч; для ПВ – до 24 ч). Плазму хранить при комнатной t o до 4 ч, иначе – заморозить. Учесть действие вводимых лекарств (гепарина); после инфузии выждать не менее 1 ч (если возможно). Недобор крови избыток цитрата, замедление свертывания

Стабильность аналитов при исследовании гемостаза АЧТВ, отдельные факторы – до 2-4 час при комнатной t о (при гепаринотерапии – до 1 час) Тромбоциты – до 2-4 час при комнатной t о. Не охлаждать! D-димер в цитратной и гепарин. плазме – до 8 час. при комн. t о. ПВ / МНО (плазма, цельная кровь) – до 24 час только при комн. t о. фибриноген, антитромбин III, протеин С в цитратной плазме, фактор Виллебранда в ЭДТА-плазме, гомоцистеин в ЭДТА- флюоридной плазме, антикардиолипиновые антитела в сыворотке - не менее суток при комн. t о.

CLSI : Collection, Transport and Processing of Blood Samples for Testing Plasma-Based Coagulation and Molecular Hemostasis Assay; Approved Guideline, fifth edition H21-A5, vol. 28, No. 5, Jan 2008 Clinical and Laboratory Standards Institute, U.S.A.

1. Наклонность к кровотечениям (в том числе у родственников) 2. Наклонность к тромбозам (инфаркты, инсульты, ТЭЛА, венозные / артериальные тромбозы и др., в т.ч. у родственников) 3. Тромбогеморрагические проявления (ДВС) 4. Выраженных нарушений гемостаза нет, но предполагается инвазивное вмешательство, в т.ч. хирургическая операция 5. Пациент принимает препараты, влияющие на свертывание (гепарин, варфарин, фибринолитики, антиТЦ препараты…) Что может наблюдаться у пациента?

Лабораторные тесты при кровоточивости

Чуть-чуть клиники… Кровотечение из слизистых оболочек – типичный признак тромбоцитарных расстройств. Кровоизлияния в мягкие ткани - типичный признак коагуляционных нарушений. Кровотечение из пупочного канатика, «отложенные» и затяжные кровотечения могут быть признаком недостаточности ф. XIII. Мультилокусные одновременные кровотечения – при острой системной коагуляционной патологии или гиперфибринолизе. Armando Tripodi 2008

1. Провести глобальный тест гемостаза – ВСК / ВАС, тромбоэластография, тромбодинамика - экспресс-исследование 2. Оценить тромбоцитарное звено гемостаза (время кровотечения, количество и агрегация ТЦ) 3. Оценить коагуляционное звено гемостаза (АЧТВ, ПВ / ПО / МНО, фибриноген / ТВ, отдельные факторы, антикоагулянты, фибринолиз…) При склонности к кровоточивости можно:

Кровь пациента ГЛОБАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ ГЕМОСТАЗА Время свертывания цельной крови (ВСК) Тест Ли-Уайта (1909 г.) - в стеклянной пробирке при комнатной t° Стандартизация (-), контроль (-), разброс результатов (+) Методика Сухарева в капиллярах Основное применение теста – экспресс-диагностика гру- бых нарушений гемостаза вне КДЛ. Основные недостатки теста ВСК : N=6-11 мин

Экспресс-коагулометры для определения ACT - времени активированного свертывания крови (для оценки степени гепаринизации при операциях с АИК) Hemochron (ITC) Actalyke (Helena)

Тромбоэластометрия / ТЭГ Измерение механических характеристик фибринового сгустка цельной крови в процессе образования и лизиса Время исследования – мин Стандартизация (+/-) Контрольный материал (-) ROTEM TEG-5000

Пьезокоагулография - АРП-01М «Меднорд» mednord-t.ru А0 – начальное агрегат- ное состояние крови t1, ИКК – параметры кон- тактной фазы коагуляции КТА – тромбиновая актив- ность ВСК – время свертывания крови ИКД – интенсивность коа- гуляционного драйва ИПС – интенсивность полимеризации сгустка Т – время формирования фибрин-тромбоцитарной структуры сгустка; ИРЛС – интенсивность ретракции / лизиса сгустка. гепарин (через 3 ч) кардиомагнил (4-е сут)

Тромбодинамика – ГЕМАКОР (только плазма) Баландина А., 2012

Тесты тромбоцитарного звена Длительность кровотечения при стандартном проколе кожи по Duke, Ivy; Количество тромбоцитов - в крови с ЭДТА. Адекватное перемешивание сразу после взятия. Не охлаждать !!! Активность тромбоцитов – по спонтанной / индуцированной агрегации.

Время кровотечения по Айви (Ivy) Рефер. интервал мин, у детей 3-12 мин. Учет времени – до 15 мин. Удлинение времени кровотечения - при ТЦ-пении, ТЦ-патии (нарушении агрегации ТЦ), болезни Виллебранда, васкулитах и др. Укорочение времени кровотечения – клинически незначимо. Чувствительность метода невысока: время кровотечения может быть нормальным при ТЦ-пении (иногда до 50×10 9 /л). Simplate II, Triplett Bleeding Time Device, скальпель, скарификатор… Учитывать: t o воздуха, t o тела, прием аспирина, НСПВ, др. лек-в, д-е алкоголя…

Количество тромбоцитов В камере Горяева – недостаточная точность, возможно занижение результатов. CV - до 25-30%. На гематологическом анализаторе – точно, в стандартных условиях, быстро. Важно предотвратить агрегацию ТЦ и ЭР (перемешивание). CV реальн = 1-2% - важно для оценки динамики количества ТЦ.

Тромбоцитопения Наиболее частая причина кровотечений. ТЦ возможно удлинение времени кровотечения и излишняя кровопотеря при хирургических вмешательствах Тяжелая ТЦ-пения ТЦ риск самопроизвольных геморрагий ТЦ высокий риск самопроизвольных кровотечений, ТЦ серьезные геморрагии (вплоть до фатальных). В костном мозге - МКЦ (при разрушении ТЦ) или МКЦ (при нарушениях продукции ТЦ).

Алгоритм лабораторного исследования при тромбоцитопении Тромбоциты < 150 х 10 9 /л Уровень Hb, количество WBC Мазок периф. крови Агрегаты ТЦ ЭР нормальные, ТЦ нор- мальные или увел. размера Фрагментация ЭР, шизоцитоз Лекарственная ТЦ-пения? (этанол, САА, хинидин, тиазиды, эстро- гены, гепарин) Инфекционная ТЦ-пения? Иммунная (идиопат.) ТЦ-пения? (СКВ, лимфома, СПИД) Врожденная ТЦ-пения? ПсевдоТЦ-пения, ЭДТА-зависимая агрегация ТЦ Микроангиопатичес- кая гемолитическая анемия / ДВС / ТТП сепсис, тромбозы, ожоги, обширные гемотрансфузии, острый промиелоцитарный лейкоз... Исследовать костный мозг норма Взять кровь с цитратом или гепарином патология Harrisons Manual of Medicine: 17 th ed., 2008

Агрегация тромбоцитов Учесть прием пациентом аспирина и НСПВ в предыд. 9 дней ! CHRONO-LOG BIOLA – 230 LA Оптические, импедансные и люминесцентные агрегометры Стандартизация (+/-); несоответствие данных на разных приборах и разными методами. Очень большой вклад в результаты вносят особенности и ошибки преаналитического этапа.

Нарушения агрегации тромбоцитов Наследственные (врожденные) ТЦ-патии - редко, Приобретенные нарушения агрегации тромбоцитов - довольно часто: на фоне приема аспирина, НСПВ и анальгетиков; при лечении адреноблокаторами, антагонистами кальция, ксантинами и др., иногда - после приема алкоголя; на фоне некоторых заболеваний (почечная недостаточность, гемобластозы, интоксикации и др.)

Плазменный гемостаз X V--> Va Образование тромбина II Образование фибринаI Общий путь (XII)XIIX VIII--> VIIIa VIII--> VIIIa Внутренний путь TF VIIa

Тесты ПВ и АЧТВ при кровоточивости АЧТВ ПВ (ПО, МНО) Наиболее частая патология врожденнаяприобретенная Норма Дефицит ф.VIII, IX, XI Ингибитор ф.VIII Волчаночный антикоагулянт (кровоточивости нет) Норма Дефицит ф. VII Гиповитаминоз K (дефицит только ф.VII) Глубокий дефицит фибриногена ( 1,2 Не было ли гемодилюции ???

Удлинение АЧТВ / ПВ – что дальше? Микст-проба 50:50 c РНП Коррекция (+) Определить факторы VIII, IX и др. Нет коррекции Скрининг на ВА Исследование на ингибиторы (гепарин, парапротеины…) Armando Tripodi 2008

Уровень фибриногена «Гипокоагуляция» - при уровне фибриногена < 1,0 г/л АЧТВ и ПВ НЕ ЗАВИСЯТ от уровня фибриногена, если он > 1-1,5 г/л - гиперпотребление (ДВС, травмы, ожоги, состояние после кровотече- ния), шок, тяжелый токсикоз, лечение фибринолитиками); - тяжелая патология печени … Клоттинг-методика (на коагулометре). Норма 2-4 г/л. Тромбиновое время (ТВ) «Фибриноген + антитромбины» - гипофибриногенемия (дисфибриногенемии) - действие гепарина, ПДФ, парапротеинов… Применение - для контроля терапии гепарином и фибринолитиками - для дифференциации причин удлинения АЧТВ / ПВ

Лабор. тесты при болезни Виллебранда Диагностика: 1.ристоцетин-кофакторная активность (vWF:RCo – на агрего- метре, реакция с ристомицином), 2. антиген фактора vWF:Ag – метод ИФА, 3.кол-во ТЦ, время кровотечения, АЧТВ, ПВ, активность ф.VIII…

Лабораторная оценка гемостаза при кровоточивости (USA) Внутр. путь гемостазаАЧТВ Внешний путь гемостазаПВ / ПО / МНО Фибринообразование Фибриноген, ТВ или рептилазное время Активность факторовф.II + V + VII или X (на базе ПВ), ф.VIII + IX + XI или XII (на базе АЧТВ), ф.XIII ингибиторы факторов Микс-тесты ПВ / АЧТВ (с инкубацией), люпус-антикоагулянт, ингибиторы ф.VIII / IX болезнь Виллебранда Активность ф.VIII, vWF:RCo, vWF:Ag, кривая ответа на ристоцетин, мультимеры vWF Функция тромбоцитов Агрегация ТЦ с АДФ, адреналином, тромбином, коллагеном, арахидонатом, ристоцетином Фибринолиз Лизис эуглобулинов, PAI-1 ДВСD-димер (колич.), АЧТВ, ПВ, фибриноген MAYO Laboratories, 2009

ИТОГ: лабораторные тесты при кровоточивости Скрининг: 1. Подсчет тромбоцитовисследование ТЦ-пении 2. Время кровотечения 2. АЧТВ (ИАЧТВ) 3. ПВ (ПТИ, МНО) 4. Фибриноген, (ТВ) Уточняющие тесты: - ф.VIII и ф.IX (активность, ингибиторы) - агрегация тромбоцитов с АДФ, арахидонатом, ристомицином - фактор Виллебранда (кол-во, активность, мультимерность) Дальнейшие тесты: - дефицит ф. XIII ? - гиперфибринолиз ? (t-PA, PAI-1, 2 -AP) - дисфибриногенемия ? Armando Tripodi 2008

Лабораторное тестирование при склонности к тромбозам

+ гиперэстрогения ( беременность, роды, послеродовый период до 4 нед, прием оральных контрацептивов…) + гомоцистеина + курение… Гиперкоагуляционные состояния / тромбофилии Вторичные (на фоне заболеваний) Операции (особенно на сердце, сосудах), тяжелые травмы костей, онкозаболе- вания и химиотерапия, гестозы, СКВ / АФС, нефротический синдром, атеро- склероз, воспаление / сепсис, HIT, выраженное ожирение… тромбофилия гиперкоагуляция Первичные (врожденные) Тромбогенные мутации (Лейден, ф.II, MTHFR…) Первичный дефицит антикоагу- лянтов (АТ III, ПрС, ПрS…) Аномалии / гиперактивность прокоагулянтов (РАПС, ф.VIII…)

Мамаев А.Н., 2008 Фактор V Лейден (FVL) Мутация гена протромбина Мутация МТГФР * C577T Дефицит АТ III Дефицит протеина С Дефицит протеина S + Мутация гена PAI-1 + Мутация гена фибриногена ,02 0,2 0,08 ? × 8 × 3 × 1,5 × × 10 × Относит. риск вен. тромбоза У населения в целом, % Вариант тромбофилии * метилентетрагидрофолатредуктаза Наиболее частые генетические тромбофилии с увеличенным риском ТГВ / ТЭЛА

Что свидетельствует о склонности к тромбообразованию? КЛИНИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ: - повторные эпизоды ТГВ, ТЭЛА, ОИМ, ОНМК и др. - венозный стаз (беременность, иммобилизация, варикоз вен…) - васкулиты, рак, миелопролиферативные заболевания - прием оральных контрацептивов, длительное введение гепарина… ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРЕДИКТОРЫ: - тромбоцитоз (> 600x10 9 /л) - выраженная гиперфибриногенемия (> 6-8 г/л) - присутствие ВА / АКЛ - дефицит АТ III, ПрС, ПрS; - избыток ф.VIII, РАПС - тромбогенные мутации G1691A, G20210A…

Ранние маркеры тромбинообразования Фрагменты протромбина 1+2 Комплекс тромбин-антитромбин Непосредственно в момент образования сгустка Фибрин-мономеры Фибринопептид А Поздний маркер F1+2 Фибрин-мономер ФПА D-димер ТАТ по А.Г.Золовкиной, РФМК… Лабораторные маркеры активации гемостаза Протромбин Тромбин АТ Фибриноген Фибрин

D-димер Наиболее надежный маркер образования / лизиса фибриновых сгустков. Определяется иммунологическими методами. Инерционный параметр (Т 1/2 = 4-8 ч). На результаты определения мало влияют техника взятия крови, примесь тромбоцитов и т.д. Нет D-димера = нет тромбов При подозрении на ТГВ/ТЭЛА: В норме - < 0,5 мкг/мл FEU, < 0,25 мг/л DDU

Уровень D-димера может быть повышен: при инфекционных и воспалительных заболеваниях, после травм и хирургических операций, особенно на крупных костях и суставах – маркер риска послеоперационного тромбоза, при злокачественных новообразованиях, при атеросклерозе и сахарном диабете – признак активности процесса. при беременности (до 3-4 раз), в пожилом возрасте, при малоподвижности и иммобилизации. NycoReaderII

ИТОГ: тесты гемостаза при склонности к тромбозам (+ анамнез и клиника!) 1. D-димер, (РФМК) – для исключения тромбоза / ТЭЛА… 2. Тромбоциты (количество), гематокрит 3. Антикоагулянты - АТ III, ПрС (состояние системы, активность) 4. Волчаночный АК, антиФЛ антитела 5. Генетическое тестирование - мутации генов ф.V, протромбина 6. Ф. VIII, гомоцистеин (избыток ?) 7. Фибриноген 8. комплекс Т-АТ, F1+2, ФМ, ФП А Перспективные тесты Активационная тромбоэластометрия Тест генерации тромбина (TGA) Тесты повреждения ЭНТ (tPA, PAI, vWF)

Лабораторная оценка гемостаза при склонности к тромбозам (USA) РАПС (aPCR) *+ мутация Лейден G1691A (ПЦР) Люпус-антикоагулянтLA-АЧТВ, dRVVT, микс-тесты Антитела к кардиолипину *IgM / IgG Антитромбин IIIХромогенный метод, антиген АТ III Гомоцистеин (натощак) *Биохимический метод / ИФА Активность ф. VIIIКлоттинговый / хромогенный метод Активность протеина СХромогенный метод, антиген ПрС Активность протеина SОбщий и свободный ПрS (антиген) Мутация гена протромбина G20210A * ПЦР-метод * - селективный профиль тестов при эпизоде тромбоза, приеме АК во время исследования или в последние дней Coagulaton Testing. Quick Guide to Coagulation Testing. Marques, MB; Fritsma, GA. AACC Press, p. MAYO Laboratories, 2009

Алгоритм диагностики причин первичного венозного тромбоза (ARUP Labs, 2004) Пациент < 50 лет с венозным тромбозом (первый случай, или «семейный» тромбоз) РАПС или мутация ф.VПатология – мутация Leiden Мутация ф.II G20210A Патология – мутация протромбина Активность протеина С Патология – недост-ть ПрС Активность протеина S Патология – недост-ть ПрS Активность AT III Патология – недост-ть AT III Гиперактивность ф.VIII ?Гипергомоцистеинемия ?

Лабораторные исследования при Д В С (тромбогеморрагический синдром, базовые тесты) 1. Активация свертывания и фибринолиза - D-димер, РФМК. 2. Потребление плазменных факторов - динамика фибриногена, АТ-III, АЧТВ, ПВ, ТВ. 3. Клеточные маркеры ДВС - динамика количества тромбоцитов и их спонтанной агрегации, умеренная анемия, шистоцитоз, фрагмен- тация эритроцитов.

Лабораторное тестирование при приеме препаратов, влияющих на гемостаз Основная цель: не допустить передозировки и развития геморрагических осложнений. Дополнительная цель: оценить эффективность терапии. Требования к методам мониторинга действия лекарственных препаратов: оперативность, доступность, информативность, стандартизация

Факторы (rVIIa), СЗП, криопреципитат, тромбоцитарная масса… Аминокапроновая к-та, транексамовая к-та, контрикал… Гепарин, Варфарин, НМГ, Дабигатран… t-PA, стрептоки- наза, урокиназа Нормальный гемостаз При кровоточивости При тромбозах Прокоагу- лянты Антикоагу- лянты Фибрино- литики Антифибри- нолитики По Lawson JH, et al. Semin Hematol. 2004;41(suppl): Аспирин, Клопидогрель, Рео Про, Эпифибатид… Антиагреганты

Лабораторный контроль гепаринотерапии Эффективность гепарина (НФГ в терапевтических дозах): 1. АЧТВ ( в 1,5-2,5 раза от нормы), ТВ 2. ACT / ВАС (point-of-care), ВСК Дополнительные тесты, риск осложнений: 3. Динамика уровня D-димера / РФМК в плазме 4. Количество тромбоцитов - опасность HIT ! (+ уровень анти-PF4) 5. AT III (не менее 70% !) Прямые ингибиторы тромбина (Лепирудин, Аргатробан; перор. – Дабигатран / Прадакса) – оценка не требуется, при ОПН / ХПН, ОПечН, тромбозе / кровотеч-и - ТВ с разведением, экариновое время, анти-ф.IIа-активность с калибровкой по Прадаксе Прямые ингибиторы Xa (Фондапаринукс, перор. – Ривароксабан / Ксарелто) – оценка не требуется (либо динамика D-димера) Гепарин связывается с БОФ, PF4, макрофагами и др., и его действующая концентрация может снижаться

Низкомолекулярные гепарины (НМГ) Можно оценить эффективность купирования тромбинемии ( D-димер, РФМК…), но не антикоагулянтное действие НМГ Доза НМГ Нужда в лаб. мониторинге Показания к лабораторному контролю анти-Ха Дополнительно Профилак- тическая – фиксиро- ванная Нет Длительное введение НМГ: - в детском возрасте - при ожирении - при почечной недостаточности (СКФ

Контроль за лечением АНД (варфарин) Дополнительно: - АЧТВ (иАЧТВ 200 % !) - D-димер / РФМК в динамике - ПрС, ПрS ( ) - (изоформы CYP2C9, VKORC1) МНО Тера- певти- ческое окно Крово- точивость Тромбоз эмболия Эффективность препаратов: - МНО со стандартизованным тромбопластином (МИЧ

INRatio (HemoSense Inc.) ProTime (ITC) CoaguChek XS (Roche Diagnostics) МНО капиллярной крови Меньшая точность и воспроизводимость результатов, зависимость от гематокрита Лучше выполнять на специальном коагуло- метре, либо использовать реактивы для малых объемов крови Hepato Quick / Thrombotest (содержат фибриноген и ф.V) Длительность взятия крови - не более с

Тест ПВ (МНО) CoaguCheck XS / Plus / Pro Roche Diagnostics 2012

Контроль за лечением фибринолитическими препаратами Риск развития осложнений: - Плазминоген (снижение; уровень д.б. не менее 65 % ) - Фибриноген (снижение; уровень д.б. не менее 1,0-1,5 г/л ) - АЧТВ (удлинение) Эффективность препаратов: - D-димер / РФМК (нарастание уровня) - Стрептокиназа (Стрептаза, Авелизин) - Урокиназа (проурокиназа) - Ацилированный комплекс плазминоген/стрептокиназа (APSAC) - Тканевой активатор плазминогена (Альтераза, Актилизе) А.Г.Золовкина, 2011

Контроль за лечением антиагрегантами Эффективность препаратов: - Агрегация ТЦ с арахидонатом / АДФ / TRAP / адреналином на оптических / импедансных агрегометрах, включая POC-тесты на аппаратах VerifyNow, Multiplate… - Тест PlateletMapping на тромбоэластографе Ингибиторы ЦОГ-1 (аспирин, кардиомагнил, тромбо АСС) Блокаторы АДФ-рецепторов (клопидогрель, тиклопидин) Ингибиторы фосфодиэстеразы тромбоцитов (дипиридамол) Блокаторы тромбоцитарных рецепторов IIb/IIIa (абциксимаб) А.Г.Золовкина, 2011 В большинстве случаев лабораторного тестирования не требуется.

Импедансные POC-агрегометры (на цельной крови) MULTIPLATE 300 мкл крови на тест оценка действия антиагрегантов ЭКО-МЕД-СМ VerifyNow® Aspirin Assay P2Y12 Assay IIb / IIIa Assay

0,8 мл крови Platelet function analyzer PFA-100 / 200 Сильно влияют [ ТЦ ] и vWF…

Тесты лабораторной оценки гемостаза Оценочные (скрининговые) тесты – лаборатории первичного звена Количество тромбоцитов, время кровотечения (только при подготовке к операциям на ЛОР-органах у детей, при геморрагиях и подозрении на недостат-ть гемостаза), АЧТВ, ПВ (МНО), уровень фибриногена, D-димер Рекомендации Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.В.Шмидта – Б.А.Кудряшова, 2011 г (пересмотр). Дополнительные тесты При кровоточивости При артер. / венозн. тромбозах Время кровотечения Кол-во ТЦ, индуцированная агрегация ТЦ Фактор Виллебранда (активность и АГ) АЧТВ, ПВ, фибриноген Факторы VIII, IX и др., их ингибиторы Лизис эуглобулинов Микс-пробы с РНП и дефиц. плазмами Количество тромбоцитов АТ III, ПрC, ПрS, аРС-резистентность Генетическое тестирование на мутации генов ф.V (Leiden) и протромбина D-димер, ф.VIII, vWF (антиген) Гомоцистеин (в динамике) Волчаночный АК (>2 раз, через 12 нед), АТ к β 2 -ГП 1

Кровоточивость Тромбозы Дефекты ТЦ звена Дефицит плазменных коагуляционных факторов и vWF Действие антикоагулянтов Нарушение сосудистой стенки Гиперактивный фибринолиз Избыток и/или гиперактивность плазменных факторов Дефицит первич- ных антикоагулян- тов (АТ III, ПрС) Повреждение тканей (включая хирургические вмешательства) Обездвиженность Онкология Take home: важнейшие причины расстройств гемостаза Paula Bolton-Maggs 2009

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ ! mail.ru