Д.м.н., профессор кафедры инфекционных и тропических болезней КазНМУ им.С.Д.Асфендиярова Шопаева Г.А г. I-ый Казахстанский Медицинский Диагностический Форум «Инновационные технологии в радиологии (КТ, МРТ, ПЭТ, УЗИ), лабораторной и функциональной диагностике» сентября 2014 г., г.Астана

HCV-инфекция Значительный рост показателей заболеваемости в мире Начиная с 1998 г., инфицированность населения вирусом гепатита С (HCV) растет с опережающей по отношению к вирусу гепатита В (HBV) быстротой Частое поражение лиц молодого возраста Высокий уровень хронизации (~ 75-85%) Исход в цирроз (27%) и первичный рак печени (25%) * Полиморфизм внепеченочных поражений Трудности лабораторной диагностики Отсутствие специфической профилактики Мультидисциплинарная проблема * Alter MJ. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol – Р.2436–41. [PMCID: PMC ] [PubMed: ]

Динамика многолетней заболеваемости острыми, хроническими вирусными гепатитами в Республике Казахстан

Заболеваемость хроническими вирусными гепатитами ( впервые выявленные ) в РК

Естественное течение HCV-инфекции Ekta Gupta, Meenu Bajpai, and Aashish Choudhary Hepatitis C virus: Screening, diagnosis, and interpretation of laboratory assays //Asian J Transfus Sci (1).- P.19–25.

Значение внепеченочных поражений при HCV-инфекции Могут приобретать ведущее значение в клинической картине болезни и быть причиной позднего распознавания хронического гепатита С «Маски» ХГ-С ревматологические дерматологические гематологическиеэндокринологическиеофтальмологические нефрологические неврологические

Хронический гепатит Цирроз, ГЦК РНК HCV AЛTAЛT HCV антитела симптомы месяцыгоды титр Острый гепатит Гепатит С симптомы

Клиническая диагностика Лабораторная диагностика Широкое распространение малосимптомных и латентных форм инфекции, высокий хрониогенный потенциал, неблагоприятные исходы, отсутствие эффективной специфической профилактики предопределяют особую значимость решению проблем ранней диагностики заболевания, генотипирования и эпидемиологического мониторинга. Требуется развитие быстрых и надежных лабораторных методов ранней диагностики, мониторинга развития и течения ВГС. Диагностика ВГС

Клиническая диагностика Лабораторная диагностика (системы ранней диагностики ВГ) Секвенирование Масс-спектрометрия Прямые методы обнаружения Методы типирования Антигенные микрочипы Серологические методы обнаружения Иммуноферментный анализ ПЦР в реальном времени Технологии на основе использования биочипов

Различают 6 генотипов HCV, которые делятся на различные субтипы (от a до z) На сегодня путем секвенирования изолятов HCV идентифицировано более чем 83 субтипа Высокая изменчивость генома HCV Устойчивость к противовирусным препаратам Вирус гепатита С

Thong VD, Akkarathamrongsin S, Poovorawan K, Tangkijvanich P., Poovorawan Y. Hepatitis C virus genotype 6: Virology, epidemiology, genetic variation and clinical implication //World J Gastroenterol 2014, March (11).-P География генотипов HCV

Распределение генотипов HCV в популяции РК Центрально-Азиатская Гастроэнтерологическая Неделя, Алматы, сентября, 2013 Исследование в РК, n= 466 Земан В.В., 2004

Определение генотипа/субтипа ВГС имеет значение для выбора оптимальной тактики терапии (продолжительность ПВТ) является предиктором ответа на терапию определяет прогноз HCV-инфекции эпидмаркирование HCV

Применение биочипов в исследовательских и диагностических целях представляет собой самую обширную область потенциального роста. Использование данной технологии позволяет определить соответствующую тактику лечения для каждого конкретного больного (персонифицированная терапия). С целью выявления и генотипирования вируса гепатита С разработана и используется тест-система INNO-LiPA HCV (INNOGENETICS, Belgium) на основе принципа обратной гибридизации со специфичными для определенного генотипа вируса гепатита С зондами, иммобилизованными в виде полос на нитроцеллюлозную мембрану 1,2. Диагностика ВГС. Использование биочипов 1 Stuyver L., Rossau R., Wyseur A. et al. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay //J.Gener.Virol. – – Vol.74. – P Maertens G., Stuyver S., Rossau R., van Heuverswyn H. Process for typing HCV isolates // United States Patent. – – No6. – 548,244 B2.

Тип 1a 1b 2a 2b 3a 3b Выявление всех ВГС const 1ab 1 а 1b 2a 2b 3 а 3b K+ на систему выявления K+ на постановку анализа Шаблоны для выявления анализируемой матрицы генотипа HCV В 2005 г. в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, Россия) был разработан способ выявления анализируемой последовательности ДНК с использованием высокоселективных олигонуклеотидных зондов на основе модифицированных («мостиковых») олигонуклеотидов (зав.лабораторией д.м.н. Пышный Д.В.).

Принцип работы ДНК-чипа Разработка ДНК-чипа основана на обратной гибридизации иммобилизованного на твердофазный носитель HCV- специфичного олигонуклеотидного зонда с высококонсервативным участком кДНК HCV. Использование составных или «сшитых» тандемов трех коротких олигонуклеотидов позволяет достоверно отличать последовательности, содержащие одну нуклеотидную замену. Данный способ диагностики реализуется посредством тест-системы, содержащей пробирку с капроновым чипом (5 х 15 мм), промывочные и буферные, а такжеферментативные растворы.

С помощью предложенного нами, совместно с разработчиками ДНК-чипа, способа диагностики вирусного гепатита С с использованием ДНК-чипов, в основе которых лежит вышеописанный способ выявления последовательности ДНК, было протестировано 65 образцов крови от больных вирусным гепатитом С (в том числе в сочетании с туберкулезом легких), проживающих в г.Алматы. Генотипирование HCV с помощью ДНК-чипов

Сканированные изображения ДНК-биочипов после проведения анализа на ПЦР-образцах ##1, 2, 5, 7, 8, 9, 11 номер ПЦР-образца 1b 2a3a 3a 3a 1 а 3b результат генотипирования с помощью тест- системы 9

Метод МетодМетод IIIIIIIIIIIIIIIIII b- 23-3a 2 3a45-3a 2 3a 22a b46-2 2a 31b- 25-1b 2 1b47-3a 2 3a 41b- 26-нет 2 нет 48-1b 2 1b 53a- 27-3a 2 3a49-3a 2 3a 61b- 28-1b 2 1b50-2 2a 73a- 29-1b 2 1b51-3a 2 3a a 2 3a52-3a 2 3a 91a- 31-3a 2 3a53-нет 2 нет 101b- 32-3a 2 3a54-нет 2 нет 113b b 2 1b55-1b 2 1b 121b1b 1 1b34-1b 2 1b56-1b 1,2 1b 131b1b 1 1b35-1b 2 1b57-нет 1,2 нет 143a3 а 1 3a36-3a 2 3a58-нет 1,2 нет 153a3 а 1 3a37-нет 2 нет 59-1b 1,2 1b 161b1b 1 1b38-1b 2 1b60-1b 1,2 1b 171bнет 1 HCV39-1b 2 1b61-1b 1,2 1b 181b1b 1 1b40-нет 2 нет 62-3a 2 3a 19-1b 1 1b41-1b 2 1b63-3a 2 3a 20-1b 1 1b42-3a 2 3a64-2 1,2 2a 21-нет 2 нет 43-3a 2 3a65-1b 1,2 1b 22-3a 2 3a44-3a 2 3a метод III метод I метод II Результаты генотипирования с использованием новой тест-системы (метод III) сопоставлены с данными, полученными референс-методами – прямого секвенирования нуклеотидной последовательности 5-UTR HCV (метод I); коммерчески доступными тест-системами «ДНК-технология», «Ампли Сенс HCV-генотип» (г.Москва, Россия)(метод II) Примечание: 1 – генотипирование HCV с использованием тест-системы «ДНК-технология» 2 – генотипирование HCV с использованием тест-системы «Ампли Сенс HCV-генотип»

Таким образом, Молекулярно-биологические методы повышают эффективность этиологической диагностики в раннем периоде HCV-инфекции. Способ генотипирования HCV на основе олигонуклеотидных ДНК-чипов позволяет проводить одновременно детекцию и генотипирование вируса гепатита С, а также дифференцировать генотип 2 (2 а, 2b) и определять субтип 3b вируса в отличие от широко используемых коммерческих тест-систем. Предлагаемый способ соответствует референс-методу (секвенирование) определения генетического материала.

Перспективы развития молекулярной диагностики (в т.ч. биочипы) вирусных гепатитов на сегодняшний день связывают с нерешенными проблемами в этой области, в частности, -прогноз течения и исхода заболевания -оценка степени активности гепатита и степени фиброза печени без гистологического исследования -прогноз эффективности ПВТ до ее начала -ранее выявление неэффективности лечения -ранняя диагностика рака печени. Реализация принципа персонифицированной терапии. Качественно новый уровень решения проблем ранней диагностики, лечения и профилактики ВГС. Молекулярная диагностика. Реалии и перспективы …

Благодарности Разработчикам методики генотипирования вируса гепатита С с использованием олигонуклеотидных ДНК-чипов – сотрудникам лаборатории нанотехнологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г.Новосибирск (зав.лабораторией д.х.н. Д.В.Пышный). Cотрудникам ПЦР-лаборатории Научной лаборатории им.Г.Кюнцигера КазНМУ им.С.Д.Асфендиярова (заведующая – канд. мед. наук, доцент Ш.А.Бейсембаева). Исследование проведено в рамках Программы прикладных научных исследований Министерства здравоохранения РК «Разработка и внедрение высокоэффективных геномных технологий в диагностику и прогнозирование течения и исходов инфекционных заболеваний», , ГР 0106РК00418.

Спасибо за внимание!