А.О.Кибитов ДНК-диагностика генетического риска развития наркологических заболеваний в рамках медико- генетического консультирования: основные принципы и опыт пилотного проекта в ФГУ «ННЦ наркологии» Национальный Научный Центр Наркологии Минзравсоцразвития РФ Москва 2011 лаборатория молекулярной генетики

Генетика наркологических заболеваний Потребление ПАВ - необходимое, но не достаточное условие для возникновения зависимости, большое значение имеют индивидуальные биологические, а также личностные и социальные особенности больного. Медицинская генетика: зависимость от ПАВ относят к обширному классу болезней с наследственным предрасположением, для которых характерны прогредиентность течения, ремиттирующий характер и нарастание тяжести симптоматики с возрастом больного. Данные классической медицинской генетики (семейные исследования и близнецовый метод): вклад наследственных факторов в развитие зависимости от ПАВ составляет 40-70%.(Goodwin D.W.1984, Crabbe J.C.,1985). С учетом того, что черты личности и характера индивидуума в значительной мере контролируются генетически, а социальное функционирование во многом зависит от черт личности, индивидуального типа реакций на стресс, также имеющих генетическую компоненту, роль генетических факторов еще более возрастает и приобретает критическое значение для конкретного человека.

Генетика зависимости от ПАВ:общие положения Мультифакториальный характер заболевания : наследуется биологическая предрасположенность к зависимости, степень и характер ее проявления зависит от социальных и личностных факторов Тип наследования предрасположенности : не подчиняется «менделевским законам», вероятно, полигенный (олигогенный) Генотип зависимости (набор вариантов генов-участников этиопатогенеза)- сложный, «мозаичного» типа Генетическая гетерогенность - разные варианты сложного генотипа имеют сходные,но не одинаковые клинические проявления Фенотип зависимости (совокупность клинических признаков)- сложный. Фенотипическая гетерогенность - варианты сочетаний качественных, количественных и динамических признаков порождают многочисленные близкие, но не одинаковые фенотипы.

Концепция генетического риска Биологическая (генетическая) предрасположенность к зависимости от психоактивных веществ (ПАВ) наследуется и закреплена генетически Среди населения существует категория лиц с врожденной предрасположенностью к развитию наркологических заболеваний - группа высокого индивидуального генетического риска развития болезней зависимости (до 11-15% по разным оценкам). Эта группа требует особого внимания специалистов, проведения интенсивных и специфических профилактических мероприятий, в том числе и превентивного медикаментозного вмешательства. Начиная употребление ПАВ, такие индивидуумы очень быстро заболевают и относятся к категории тяжелых больных, часто резистентный к стандартной патогенетической терапии, течение зависимости у них, как правило, безремиссионное с быстрым и неблагоприятным исходом. Выявление таких лиц, в том числе методами молекулярно-генетической диагностики, и проведение среди них соответствующих профилактических мероприятий может значительно снизить заболеваемость наркоманиями и алкоголизмом.

Генетический риск и ДНК-диагностика Генетический риск- вероятность развития заболевания, обусловленная генетическими факторами. Уровень риска- категориальная (ранговая, качественная) оценка вероятности развития заболевания. Генетические маркеры риска- варианты структуры ДНК, носительство которых увеличивает вероятность развития заболевания. Реализация риска- возможна при совместном действии генетических, личностных и социальных факторов (мультифакториальность). ДНК-диагностика- диагностические тесты и мероприятия, основанные на анализе ДНК индивидуума. В том числе- выявление генетических маркеров риска. Диагностика признаков генетической предрасположенности к зависимости от ПАВ на самом раннем этапе развития зависимости или до начала заболевания, является основной задачей медико-генетического консультирования в наркологии.

Медико-генетическое консультирование Выявление генетической предрасположенности к зависимости от ПАВ на самом раннем раннем этапе развития зависимости или до начала заболевания, является основной задачей медико- генетического консультирования в наркологии. Главной целью консультирования является предупреждаение консультируемого о степени его индивидуального биологического риска и рекомендации по превентивно- коррекционным мероприятиям, дающим возможность полноценной жизнедеятельности ОБЬЕКТИВНЫЕ ТРУДНОСТИ: Полигенная и мультифакториальная природа заболевания Вероятностный характер результата консультирования Невозможность 100% диагностирования предрасположенности Поисковый характер многих маркеров Высокая стоимость ряда исследований

Медико-генетическое консультирование ЭТИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ: Широко распространенное в обществе отношение к болезням зависимости как к позорным, скрываемым от окружающих и самого себя, социально осуждаемым заболеваниям. Опасность понимания результата консультирования как предопределенности, возможный отказ от попыток изменить образ жизни Вероятностный характер результата консультирования дает возможность субьекту игнорировать рекомендации по превентивно-коррекционным мероприятиям ПЕРСПЕКТИВЫ: Успешная верификация основных клинических и биологических маркеров зависимости Возможность количественной оценки риска развития зависимости Разработка стандартов общедоступных превентивно-коррекционных мероприятий для лиц с высоким генетическим риском Расширение спектра видов зависимости (аддиктивные состояния) Снижение стоимости исследований Внедрение процедуры консультирования в практику профильных медицинских учреждений

Оценка генетического риска-гена профилирование В лаборатории молекулярной генетики ННЦ наркологии разработана и развивается концепция молекулярно-генетического профиля (генной профиля) зависимости от ПАВ, как совокупности полиморфных генетических детерминант (маркеров), наиболее полно описывающих состояние зависимости от ПАВ. В качестве элементов генной профиля используются полиморфные маркеры генов системы ДОФАМИНА-основного нейрохимического субстрата этиопатогенеза болезней зависимости от ПАВ (Анохина И.П ). Построенный нами на основании теоретических предпосылок гена профиль болезней зависимости оказался эффективным инструментом молекулярно-генетической диагностики риска зависимости от ПАВ, все элементы генной профиля оказались связаны с болезнями зависимости, хотя и в разной степени. Все это делает возможным успешное применение генной профиля в качестве диагностической системы для оценки как общего, так и специфического (отдельно алкоголизма и героиновой наркомании) генетического риска. Взаимосвязь элементов генотипического профиля, характерная для лиц с разным уровнем риска, выявлена нами в длительных групповых исследованиях на репрезентативных выборках. (Кибитов А.О. Наркология , с.25-42).

Молекулярно-генетический профиль ( гена профиль, генотипический полигенный профиль ) Генопрофиль : система взаимосвязанных генетических детерминант, совокупность вариантов которых наиболее полно характеризует полигенное заболевание. Элементы генной профиля : полиморфные варианты аллелей, генотипов, гаплотипов по нескольким генам, вовлеченным в этиопатогенез заболевания. Полиморфизм гена - наличие в гене вариабельных (полиморфных) участков, структура которых различна в популяции и существует в нескольких вариантах. ПРИМЕР: DBH 444 A->G. Аллель -вариант последовательности нуклеотидов (один нуклеотид- SNP, несколько-STR, VNTR) на одной из цепей ДНК. ПРИМЕР: аллель А Генотип - сочетание аллелей на обеих цепях ДНК. ПРИМЕР: генотип АА(либо- AG,либо-GG) по локусу DBH 444 A->G. Гаплотип - сочетание генотипов сразу по нескольким полиморфным локусам одного гена. ПРИМЕР: гаплотип по локусам DBH 444 A->G и С->Т: (АG;CT)

Полигенный профиль Сочетание полигенного характера и мультифакториальности болезней зависимости делают методически не верным поиск единственного или главного «гена зависимости». С развитием молекулярной генетики сложных мультифакториальных заболеваний полигенной природы, в том числе и болезней зависимости от ПАВ, стало понятно, что гены, влияющие на ряд функций мозга, играют аддитивную роль, как факторы риска развития заболевания. Риск развития зависимости от ПАВ является следствием влияния значительного числа генов, каждый из которых вносит небольшую долю в суммарный риск. Многие из генов- кандидатов, были первоначально постулированы на основе экспериментальных данных.

Нейрохимической основой зависимости от ПАВ являются длительные патологические изменения в работе дофаминовой нейротрансмиттерной системы мозга. В нашем исследовании мы включили в гена профиль шесть основных генов, контролирующих центральную дофаминовую нейромедиацию на нескольких уровнях или звеньях: Пресинаптическое рецепторное звено: ген дофаминового рецептора типа 2 (DRD2) Постсинаптическое рецепторное звено: ген дофаминового рецептора типа 4 (DRD4) Звено синаптического транспорта:ген белка-переносчика дофамина (DAT) Биосинтетическое звено: ген фермента тирозингидроксилазы (TH) Метаболические звенья: основное - ген фермента дофамин- бета-гидроксилазы (DBH) и дополнительное-ген фермента катехол-орто-метилтрансферазы(COMT). Принципы построения генной профиля

Дофаминэргическая нейротрансмиттерная система и элементы генной профиля DRD4 DAT DRD2 Тирозин Тирозингидроксилаза (ТН) L-Дофа ДОФА- декарбоксилаза ДОФАМИН Дофамин-бета- гидроксилаза (DBH) норадреналин Катехол-орто- метилтрансфераза (СОМТ) Фенилэтаноламин-N- метилтрансфераза (PNMT) адреналин Моноаминоксидаза (МАО В) Элементы генной профиля

Характеристика элементов генной профиля ДА системы

Практическое применение генной профилирования В рамках медико-генетического консультирования необходимо проводить прямое изучение элементов генной профиля болезней зависимости у конкретного индивидуума- гена профилирование. Генопрофилирование, проводимое в целях ДНК-диагностики, позволяет оценить уровень генетического риска развития заболевания и вклад различных вариантов структуры генов (локусов полиморфизма) в формирование заболевания. По результатам генной профилирования возможна ранговая количественная оценка генетического риска развития зависимости от ПАВ путем построения и анализа индивидуального генной профиля (ИГП). Сравнение ИГП с общим, статистическим генопрофилем зависимости от ПАВ дает возможность оценить индивидуальный генетический риск развития наркологических заболеваний. ?? ?

ПИЛОТНЫЙ ПРОЕКТ: ЦЕЛИ и ЗАДАЧИ Валидизация предложенной системы оценки генетического риска Изучение характера и распределения уровней (степеней) генетического риска у стационарных наркологических больных Изучение связи уровней генетического риска с анамнестическими и клиническими характеристиками больных Оценка влияния уровня генетического риска у конкретного больного на клиническую картину заболевания и эффективность комплексной терапии ПЕРСПЕКТИВА: разработка терапевтических программ, специфичных и максимально эффективных для разных уровней генетического риска. ?? ?

Массив пациентов и источники данных Пациенты, госпитализированные в Клинику ФГУ «ННЦ наркологии» за период июнь-июль 2011 г*. Всего: 199 человек, из них 37(18,59%)-женщины. ДИАГНОЗЫ: Зависимость от алкоголя 2-3 стадии (F-10.2 по МКБ-10): 157(78,89%) Зависимость от прочих ПАВ (опиаты,каннабиноиды, стимуляторы)-42(21,11%). Анамнестические и клинические данные: анкета пациента (Кибитов А.О., Винникова М.А., гг.) Генетические данные: забор венозной крови на генотипирование при поступлении больных. Генотипирование (short set): Для генотипирования были выбраны 5 полиморфных локусов 3-х ключевых генов, кодирующих основные элементы ДА системы (дофаминовые рецепторы типов 2 и 4, тирозингидроксилаза). Образцы ДНК, полученные из венозной крови, генотипировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. *- проект предполагает включение в исследование 100% поступивших больных

Дизайн исследования ДИЗАЙН: ДВОЙНОЕ СЛЕПОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ: на момент проведения ДНК-диагностики (лаб.молекулярной генетики), данные анамнеза и клинические данные не доступны на момент заполнения Анкеты пациента (лечащие врачи Клиники) данные ДНК- диагностики не доступны. Уровень 1. ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РИСКА ПАЦИЕНТА ( гена профилирование, ДНК-диагностика) Уровень 2. Анализ связи данных анамнеза с уровнем генетического риска. Уровень 3. Анализ связи клинических данных и эффективности комплексной терапии с уровнем генетического риска.. Источник данных: оригинальная «Анкета пациента» (Кибитов А.О.,Винникова М.А., гг) с включением количественных шкал (VAS, BDS и проч.). Заполняется лечащим врачом по результатам обследования и лечения больного.

Оценка генетического риска МАРКЕРЫ ОБЩЕГО РИСКА: гены DRD2 (2 локуса)и DRD2 TH МАРКЕРЫ РИСКА АЛКОГОЛИЗМА: ген DRD4(1 локус) МАРКЕРЫ РИСКА НАРКОМАНИИ: ген DRD4(2-а локуса)

Пример заключения

Распределение уровней генетического риска в общем массиве пациентов ( гендерные различия ) У женщин КРАЙНЕ ВЫСОКИЙ уровень риска встречается реже. р=0,027; OR=1,38 [CI 95% 1,07; 2,63]). _ _

Распределение уровней генетического риска в общем массиве пациентов ( диагнозы ) Распределение уровней риска идентично у больных с разными диагнозами. _

Распределение уровней генетического риска в общем массиве пациентов ( семейная отягощенность по наркологическим заболеваниям ) Наличие отягощенности приводит к увеличению доли ВЫСОКОГО (р=0,016) и СРЕДНЕГО ( р = 0,033) риска. Высокая плотность отягощенности (2 и более родственников) приводит к резкому увеличению доли СРЕДНЕГО риска (р=0,011) и снижению доли НИЗКОГО риска. _ _ _ _ _ _ FH0- нет отягощенности FH- есть отягощенность FH1- средняя степень отягощенности FH2- высокая степень отягощенности

Распределение уровней генетического риска в общем массиве пациентов ( возраст больных ) У молодых больных высокая доля КРАЙНЕ ВЫСОКОГО РИСКА (р=0,006 (средний возраст) и р=0,013 (зрелый возраст) при снижении доли ПОВЫШЕННОГО РИСКА (р=0,019 средний возраст) и р=0,033 (зрелый возраст. _ _ _ _ _

Распределение уровней генетического риска в общем массиве пациентов ( сочетанное употребление ПАВ ) У пациентов, потребляющих 2 вида ПАВ, повышена доля КРАЙНЕ ВЫСОКОГО РИСКА (р=0,026) и снижена доля СРЕДНЕГО риска (р=0,022). У пациентов, потребляющих 3 и более вида ПАВ, максимальная доля СРЕДНЕГО РИСКА (р=0,011 и р=0,015 при снижении долей ВЫСОКОГО и КРАЙНЕ ВЫСОКОГО риска ( тренд). _ _ _ _ _ _ _

Распределение уровней генетического риска в общем массиве пациентов ( стартовый балл по шкале VAS ) Рост стартового показателя шкалы VAS пропорционален снижению доли НИЗКОГО РИСКА (р=0,013, р=0,018), росту доли КРАЙНЕ ВЫСОКОГО РИСКА (р=0,028) и ПОВЫШЕННОГО риска (р=0,032). СРЕДНИЙ уровень риска связан со СРЕДНИМИ показателями ШКАЛЫ. _ ___ _ _ _

Предварительные выводы Генопрофилирование как способ оценки генетического риска развития болезней зависимости от ПАВ в рамках ДНК-диагностики показал удовлетворительную валидность: в двойном слепом исследовании показано, что до 90% стационарных наркологических больных имеют уровень генетического риска не ниже среднего, а до 70%- уровни выше среднего, высокий и крайне высокий, не зависимо от наркологического диагноза и пола. АНАМНЕЗ: Уровень генетического риска связан с семейной отягощенностью по наркологическим заболеваниям и ее плотностью, что сообщает оценке риска специфичную валидность. КЛИНИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ: Уровень генетического риска обратно пропорционально связан с возрастом больных- у молодых пациентов значения риска выше. Уровень генетического риска связан с количеством ПАВ, потребляемых сочетанно. Уровень генетического риска связан с уровнем патологического влечения при поступлении больного (высокие показатели стартовой шкалы VAS характерны для больных с высокими уровнями риска).

? Генопрофилирование: инструкция по применению Устойчив к лечению Отвечает на лечение _ Генопрофилирование ? ? ? ? Успешная терапия ? ? ?

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ КРУГЛЫЙ СТОЛ «Медико-генетическое консультирование в наркологической практике». 21 октября 2011 г.: Мини-доклады по практическому применению генной профилирования Обсуждение, дискуссия и вопросы ОБУЧЕНИЕ : ФГУ «ННЦ наркологии» проводит циклы повышения квалификации по теме: «Медико-генетическое консультирование в наркологической практике». На прохождение циклов приглашаются: руководители подразделений, руководители клинических лабораторий, специалисты по лабораторной диагностике учреждений здравоохранения наркологического профиля, врачи психиатры-наркологи, клинические психологи. Длительность проведения курса: 5 дней, 40 академических часов. Проведение курсов планируется 21 – 25 ноября 2011 г. Внимание! Срок окончания приема заявок-01 ноября 2011 г. Дополнительную информацию Вы можете получить по тел/факс: (499) ; (499) ; www. nncn.ru.,

БЛАГОДАРНОСТИ Коллегам по лаборатории молекулярной генетики ФГУ «ННЦ наркологии»: к.м.н. Воскобоевой Е.Ю., Чупровой Н.А., к.б.н. Бродянскому В.М., к.б.н. Мелькиной О.Е. Зам.директора ФГУ «ННЦ наркологии» академику РАМН проф.Анохиной И.П. Заведующим клиническими отделениями и врачам Клиники ФГУ «ННЦ наркологии» и лично зам.главного врача Бабичевой Л.П. Зам.директора ФГУ «ННЦ наркологии» проф.Винниковой М.А. Директору ФГУ «ННЦ наркологии» проф.Кошкиной Е.А. за административную поддержку проекта

Лаборатория молекулярной генетики КОНТАКТЫ: Национальный научный центр наркологии Минздравсоцразвития России, Лаборатория молекулярной генетики Москва, М.Могильцевский пер., 3, (499) , www: druggen.ru Благодарю за внимание!