Методы изучения генетического полиморфизма растений и животных. Штрих-кодирование Выполнила: магистр 1 года обучения гр М1 Красногорова Н.В.

(ПДРФ, Restriction fragment length polymorphism, RFLP) заключается в ПЦР-амплификации интересующего фрагмента и его последующем расщеплении соответствующей рестриктазой Т.е. это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель- электрофореза (ДНК электрофореза) Метод включает в себя следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК, идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузерну. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

Рис. 1. ПДРФ, расположенный в гене нормального гемоглобина, отсутствует в фамильном гене, вызывающем серповидно-клеточную анемию. Это позволяет ставить диагноз болезни, используя метод ПДРФ.

Достоинства: Очень дешев - цена зависит только от цены рестриктазы, не требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования, всем необходимым оснащена любая ПЦР-лаборатория, занимающаяся, например, диагностикой инфекций, возможно генотипирование единичных образцов ДНК. Недостатки: Достаточно долгое время анализа - более 6-8 часов до получения результата, низкая производительность, отсутствие возможности автоматизации. Коммерческая доступность: Отечественными фирмами продаются наборы как и для уже давно известных полиморфных маркеров, так и для новых полиморфизмов. Оборудование: Стандартное оборудование ПЦР-лаборатории. Область применения: Типирование средних по размеру выборок (до нескольких сотен образцов), до полиморфных маркеров. Стоимость расходных материалов: руб. на пробу на один полиморфный маркер.

Полиморфизм длины амплификационных фрагментов (ПДАФ, AFLP - amplification fragment length polymorphism) - Аналогичен полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, но меняются местами этапы амплификации и рестрикции. Применяется для повторов и полиморфизмов типа вставка/удаление. Рис. 2 AFLP анализ штаммов E.coli. По два независимых анализа штаммов BL21, BL21F'IQ, DH5[alpha], DH5[alpha]F'IQ, HB101. Стрелками отмечены полиморфные сайты. Достоинства и недостатки как у ПДРФ Коммерческая доступность: Отечественными фирмами продаются наборы как и для уже давно известных медикам полиморфных маркеров, так и для новых полиморфизмов. Широко используется в наборах для идентификации личности.

Аллель-специфичная амплификация с детекцией результатов электрофорезом (allele- specific PCR) Объединяет в себе множество подходов, но основная идея заключается в том, что полимераза с разной эффективностью обрабатывает полностью спаренный и неспаренный нуклеотид на 3`-конце праймера. Аллельные варианты различаются за счёт того, что 3' концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с позицией SNP. Степень дискриминации мисматчей можно повысить вводя дополнительный, неспаренный нуклеотид во второй или третей позиции с 3' конца этого же праймера. Ещё один способ повышения специфичности - проведение в той же пробирке конкурирующей ПЦР реакции.

Рис. 3. Реактив ДНК- экспресс кровь Рис. 4. Анализ геномной ДНК человека, выделенной из лейкоцитов цельной крови Анализу подвергается геномная ДНК человека, выделенная из лейкоцитов цельной крови или из слюны С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации с аллель-специфичными праймерами. В зависимости от формата набора детекция результатов проводится в режиме реального времени или методом электрофореза в агарозном геле. Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.

Рис. 5. Анализ геномной ДНК человека, выделенной из слюны

Рис. 6. Электрофореническая схема детекции и детекция результатов с помощью Real-time ПЦР

Аллель-специфичные зонды (allele-specific hybridization) Основан на способности полимеразы разрушать встречающиеся комплементарные олигонуклеотиды зонды (5`->3` экзонуклеазная активность). Зонд содержит флуоресцентный краситель на 5`-конце и тушитель флуоресценции на 3`-конце. Полностью комплементарный зонд (один аллель) расщепляется полимеразой, краситель высвобождается и сигнал флуоресценции, соответствующий этому аллелю, растет. Дуплекс с зондом с одним неспаренным нуклеотидом (второй аллель) имеет меньшую температуру плавления и не разрушается, а отщепляется полимеразой целиком. По отношению уровней флуоресценции от обоих зондов судят о наличии в пробе одного или другого аллеля.

Основная разница между наборами разных производителей – в методах увеличения различия в температурах плавления, что определяет качество дискриминации аллелей, и улучшения соотношения сигнал/шум, что определят чувствительность. Достоинства: Не требует высокой квалификации персонала, обладает высокой производительностью, возможна автоматизация. Недостатки: Большой срок поставки зарубежных наборов, сложности с генотипированием единичных образцов (возрастает стоимость). Коммерческая доступность: Наборы TaqMan® SNP Genotyping Assays от Applied Biosystems, наборы сFLASH-детекцией, наборы AmpliFlash Оборудование: Стандартное оборудование ПЦР-лаборатории, ПЦР-детектор "Джин" (для малых выборок, 2000 евро) или реал-тайм амплификатор (для больших выборок, от 20 тыс. евро). Область применения: Типирование средних и больших по размеру выборок (до нескольких десятков тысяч образцов), до полиморфных маркеров.

Элонгация праймера (SBE – single-base primer extension) Основан на присоединении дидезоксинуклеотида, комплементарного позиции SNP, к 3`-концу праймера и последующей детекции продукта присоединения различными методами – капиллярным электрофорезом (SNaPShot), масс- спектрометрией (MassARRAY), ДНК-микрочипами и т.д. Решение на базе проточной цитофлуорометрии (Luminex 100) отличается не только чрезвычайно высокой производительностью, но и чрезвычайно высокой ценой (более 100 тыс. евро).

Достоинства: Подходит для анализа единичных образцов по большому количеству полиморфных маркеров для диагностических целей, возможна автоматизация. Недостатки: Требуется высокая квалификация персонала, дорогостоящее оборудование, большой срок поставки зарубежных наборов, большое время анализа одного образца (до суток в случае биочипов). Коммерческая доступность: Наборы SNaPshot® Multiplex System от Applied Biosystems, MassARRAY® iPLEXот Sequenom, многочисленные решения на базе биологических микрочипов. Оборудование: Стандартное оборудование ПЦР-лаборатории, секвенатор (от 100 тыс. евро), масс-спектрометр (от 200 тыс. евро), сканеры биочипов (от 50 тыс. евро). Область применения: Типирование малых по размеру выборок (до нескольких десятков образцов, исключая Luminex до десятков тысяч образцов), до полиморфных маркеров (зависит от реализации), диагностика.

Лигирование олигонуклеотидных зондов (oligonucleotide ligation assay) При проведении этих реакций специфические ДНК- или РНК-последовательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотидных зондов. Метод включает несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации.

Рис. 7. Лигирование а) к одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать; б) синтезируют короткие олигонуклеотиды зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырёх нуклеотидов А, Т, G или С, в) после того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером

Достоинства: Подходит для анализа единичных образцов по большому количеству полиморфных маркеров для диагностических целей, возможна автоматизация. Недостатки: Требуется высокая квалификация персонала, дорогостоящее оборудование, большой срок поставки зарубежных наборов, большое время анализа одного образца. Коммерческая доступность: Наборы SNPlex Genotyping System от Applied Biosystems. Оборудование: Стандартное оборудование ПЦР-лаборатории, секвенатор (от 100 тыс. евро). Область применения: Типирование малых по размеру выборок (до нескольких десятков образцов, до полиморфных маркеров, диагностика.

Гибридизация олигонуклеотидных зондов (Hyb Probes) - основан на тримолекулярном взаимодействии ДНК и двух зондов в области нуклеотидной замены и различий в кривых плавления. Достоинства: Простота дизайна, возможна автоматизация. Недостатки: Требуется поддержка необходимых режимов в амплификаторе. Коммерческая доступность: Метод развивает "ДНК- технология". Оборудование: Стандартное оборудование ПЦР-лаборатории, реал-тайм амплификатор (от 20 тыс. евро). Область применения: Диагностика.

Рис. 8. Схема аллель-специфического удлинения праймеров, иммобилизованных на матрице

Дискриминация аллельных вариантов электрофорезом - SSCP (single strand conformation polymorphism) и анализ гетеродуплексов первыми начали применяться для обнаружения полиморфных участков ДНК. Благодаря простоте и относительно высокой чувствительности эти методы постоянно модернизируются и широко используются и в настоящее время.

Полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК Традиционный SSCP анализ включает денатурацию ПЦР-продуктов и разделение их в неденатурирующем геле (Pис. 9). Электрофоретическая подвижность одноцепочечных фрагментов зависит в этом случае от их нуклеотидной последовательности, определяющей характер вторичных и третичных структур, и меняется даже при отличии в один нуклеотид. Простота метода, умеренная стоимость и возможность использования флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза (ABI Prism 310) позволяет легко автоматизировать процесс и анализировать одновременно большое количество локусов. Рис. 9. SSCP генотипирование 10 cDNA локусов. Представлены генотипы двух P1 родителей, двух F1 родителей и 9 F2 потомков.

Анализ гетеродуплексов В этом случае денатурированные тостерный и анализируемый ПЦР-продукты не разделяют в геле, а сначала позволяют им ренатурировать. Одноцепочечные фрагменты образуют дуплексы. Если последовательности двух цепей полностью комплементарны, то будут образовываться гомодуплексы, если они отличаются хотя бы на один нуклеотид - гетеродуплексы. Гомо- и гетеродуплексы имеют разную электрофоретическую подвижность и могут быть разделены в неденатурирующем геле. В лабораторных исследованиях меченые Су-5 ПЦР-продукты с известным нуклеотидом в позиции SNP смешиваются с анализируемыми ПЦР-продуктами.

Масс-спектрометрическое секвенирование Альтернативой существующим методам детекции полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвенирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца этим методом составляет всего несколько секунд. На примере гена ТР53 было показано, что метод очень чувствителен, достоверно детектирует гомо- и гетерозиготы и позволяет оценить долю SNP при анализе нескольких образцов одновременно. Ионизированные молекулы ДНК отрываются от подложки методами MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionisation) и ESI (electrospray ionisation). Они разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную камеру к детектору. Время движения регистрируется. Время обратно пропорционально скорости молекулы, которая, в свою очередь прямо пропорциональна отношению массы летящей молекулы к ее заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) - уникальны для каждой молекулы и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью, поэтому чувствительность метода чрезвычайно высока. Метод позволяет работать с нанолитрами образца. Масс-спектрометрический анализ успешно применяется для визуализации результатов детекции SNP другими методами, например минисеквенированием или инвазивным расщеплением.

Резонансный перенос энергии флуоресценции Резонансный перенос энергии флуоресценции - ещё одно физическое явление, активно использующееся для SNP анализа. Оно позволяет следить за состоянием молекулы зонда в пробирке оптическими методами, непосредственно в ходе реакции. Принцип явления заключается в том, что если два флуорофора расположены в непосредственной близости друг от друга (в большинстве реализаций метода - на одном олигонуклеотиде) и спектр испускания первого совпадает со спектром поглощения второго (тушителя), то при возбуждении первого вместо флуоресценции будет происходить передача энергии на тушитель. При увеличении расстояния между флуорофором и тушителем (например, если какой либо из флуорофоров отщепляется от олигонуклеотида) флуоресценция восстанавливается.

Рис. 10. Аллельная дискриминация с помощью 5' нуклеазного (TaqMan) анализа. Присутствие мисматча оказывает влияние на эффективность расщепления зонда.

Рис. 11. Аллельная дискриминация с помощью 5' нуклеазного (TaqMan) анализа. Представлены величины конечной флуоресценции для 43 независимых анализов.

Флуоресценция, зависящая от локального окружения Использование в качестве репортерного флуорофора terbium chelate позволяет проводить TaqMan подобный анализ без использования тушителя, так как флуоресценция terbium chelate зависит от локального окружения и гораздо слабее в ассоциации с одноцепочечной ДНК, чем в растворе.

Штрихкодирование Рис. 12 ДНК-штрихкодирование ( ДНК-штрихкодирование – новый метод каталогизации биологического разнообразия – основан на том, что каждый из существующих на планете видов животных и растений можно однозначно идентифицировать по сравнительно небольшому фрагменту его генома.

2003 год – канадский ученый Пол Хеберт (Paul Hebert ) предложил использовать для видовой идентификации живых организмов короткие стандартные последовательности цепи ДНК (это и называется ДНК-штрихкодированием, DNA barcoding) 2004 год – был основан международный консорциум «Штрихкод жизни» («Consortium for the Barcode of Life, CBOL ) 2005 год – Россия присоединилась к этому проекту. И вступило 69 организаций из 31 страны (университеты, естественно-научные музеи, зоопарки, ботанические сады, агентства, занимающиеся природоохранной деятельностью, и т.д.) 2006 год – их численность составила 133. Конечная цель проекта – «идентифицировать» все известные и пока неизвестные виды и дать возможность легко определять принадлежность того или иного организма к конкретному виду. Сейчас биологами описано около 1 млн. 700 тыс. видов животных и растений (не считая микробов). Предполагается, что всего существует не менее 10 млн. видов, то есть большинство их еще не выявлено.

Сформированы два подпроекта: Fish-BOL, по которому будут даны «штрих-коды» видов морских и пресноводных рыб и «Птицы Северной Америки» ( видов кодированы к 2010 году). К 2006 г. кодированы видов рыб год – прошла вторая международная конференция по описанной проблематике в рамках глобальной инициативы (Тайбэй, сентябрь 2007). В России начал реализовываться пилотный проект по штрих-кодированию видов рыб. И было проведено рабочее совещание по этой теме (Владивосток, июня 2007 г.). Программа «Штрихкод Жизни» особенный упор делает на стандартизацию и координирование работы. Информация о живых организмах, чьи штрихкоды вносятся в библиотеку, обязана быть максимально четкой.

«Штрихкод Жизни» предполагает создание библиотеки ДНК- штрихкодов (ДНК-ШК) для всех видов, живущих на планете, путем прочтения одного и того же участка генома каждого из них. Основные требования к эталонному участку ДНК: 1) небольшой размер (от 500 до нуклеотидов); 2) последовательность нуклеотидов ДНК-ШК должна быть одинаковой у особей одного вида и достоверно различаться у особей разных видов; 3) во избежание ошибок последовательность нуклеотидов должна быть прочитана в обоих направлениях (с обеих цепочек ДНК); 4) необходимо знать прямой и обратный праймеры, чтобы можно было без труда выделить нужный участок ДНК из клеток исследуемого организма; 5) количество полиморфных (т.е. различающихся у разных особей одного и того же вида) позиций (нуклеотидов) в последовательности не должно превышать 1%.

Прокариоты: в группу каталогизируемых живых организмов не попадают пока по причине отсутствия у них митохондрий как таковых. Растения: фрагмент СО1 (5'-фрагмент первой субъединицы митохондриального гена, кодирующего белок цитохром-С- оксидазу) не подходит в качестве эталона в силу низкой и очень неравномерной вариабельности этой последовательности. Поэтому штрихкодирование растений осуществляют при помощи других фрагментов ДНК (ITS, ядерная рРНК, участки хлоропластного генома). Грибы: длина СО1 существенно варьирует из-за присутствия интронов, поэтому в филогенетике грибов используют различные последовательности ядерной ДНК. Животные: уровни внутри- и межвидовой вариабельности фрагмента СО1 различаются в среднем в раз, и метод ДНК-ШК в целом неплохо работает.

Рис. 13. Расшифровка штрихкода (последовательности нуклеотидов) пчелы и малиновки (

Рис. 14. Мечта участников проекта «Штрихкод жизни» - миниатюрный ДНК-штрихкодер. ( Рис. 15. Карманный мобильный секвенатор (

Обнаружение в каком-то таксоне группы организмов, отличающихся только по ДНК-ШК, не означает автоматического присвоения этой группе нового видового статуса, а скорее подчеркивает необходимость дальнейшего изучения таксона. Безусловным преимуществом обсуждаемого метода является его демократичность. Во-первых, планируется возможность комментариев и критики внесенных данных не только самими авторами, но и третьими лицами. Во-вторых, стандартизированная библиотека штрихкодов находится в свободном сетевом доступе. В-третьих, появление миниатюрных компьютеризованных секвенаторов, разработке которых уделяется большое внимание, позволит практически на бытовом уровне определять живые организмы обыкновенным людям (не специалистам-систематикам), что значительно расширит описание биоразнообразия в местном и глобальном масштабе.

Области практического применения ДНК-штрихкодирования: экологический мониторинг, карантинные службы, медицина, ветеринария, криминалистика, судебно-медицинская экспертиза, контроль лекарственных средств и продуктов питания.

Спасибо за внимание!