Векторлардың сайттары - презентация

1 Векторлардың сайттары

2 Плазмидалар Клеткалық ДНҚ бактериялардың негізгі бөлігі хромосомада болады(мысалы е.coli дің хромосомасында 4 млн нуклеотидтер қатары бар). Дегенмен хромосомалық бактериялардан басқа өте кішкентай дөңгелек, ұзындығы үлкен молекулалық ДНҚ плазмидті бірнеше мың базалық жұп саны бар(молекулалық массасы 1,5-300 мегадальтон, 1МД=1500). Мұндай шағын- хромосомаларды плазмидалар деп атайды. Алайда, плазмидалар құрамы антибиотикке төзімді гендерден, ауыр металл иондарынан(R-плазмида), сондай –ақ белгілі органикалық қосылыстардың тексеруші катаболизм гендерінен тұрады(плазмидалық биодеградации немесе Д-плазмиды).Сондықтан бұл гендер плазмидада табылған, олар анағұрлым көп санды көшірмелерін ұсынылған.Жоғары көшірмелі плазмидтер клеткалық синтезде үлкен мөлшерде ферменттерді, химиялық бейтараптандырылған антибиотиктерді немесе ксенобиотиктерді қамтамасыз етеді. Плазмидалар көрсетілгендіктен, олар әртүрлі штаммдарды және бактериялар түрлерін бөліп шығарады, бірақ міндетті геномды компоненттері болып табылмайды, біраз табиғи штаммдардан плазмидалар

3 Ең бір жиі қолданылатын плазмидалар клондалған pBR 322 жасау пайданылатын E. Coli дің табиғи плазмидтері оқшауланған.Бұл плазмидалар төзімді 2 антибиотик гендері: ампициллин және тетрациклин, әрі төзімді гендерге бұл антибиотиктер рестрикциялық сайттары болуы керек. Егерде бөтен ДНҚ фрагменттері төзімді гендердің біріне еңгізілсе, онда соңғысы инактивтендіріледі. Демек, дұрыс еңгізілген бөтен ДНҚ фрагменттерінің біріне гендегі антибиотиктері төзімді бактериялар детектрлеуі жоғалуы мүмкін. Бірақ, басқа антибиотиктерде төзімлігі сақталады. Осылайша, векторлар тек сол бактериялық клондалған құрамында рекомбинантты плазмидаларын анықтауға мүмкіндік береді.

4

5 Космидалар мен фазмидалар ДНК фагтарынан және плазмидалардан тұратын гибридті векторлар бар, мысалы, оларға космидтер мен фазмидтер жатады. Космид лямбда фагтың соs учаскесі (жабысқақ ұштар) бар плазмида яғни тіршілігі екі жақты ДНҚ-ның гибридтік молекуласы. Космидтік плазмидалық бөлігі оның бактерияларда репликациялануына мүмкіндік береді, ал лямбда фагтың геномына жататын бөлігі - соs тізбек космидтің фаг капсидінің ішіне in vitro жағдайында оралуына және реципиенттік клеткаға трансдукциялануына мүмкіндік береді. Сонымен, космидтер клеткаға трансформация жолымен емес, кәдімгі инфекция арқылы ене алады. Фазмида-Фаг ретінде де, плазмида ретінде де дамуға қабілетті фаг пен плазмиданың арасындағы гибридтерді айтамыз. Мұндай векторда СоlЕ1 мен λ фагтың инициация нүктесі бар және олар бактериофаг сияқты лизистік, плазмидалар сияқты лизистік емес дамуға қабілетті.

6

7 Вероидтар 1971 жылы ақуызды қапшығы жоқ және тек инфекциялы молекуласы біртізбекті сақиналы РНҚ дан, нуклеотидтен тұратын инфекционды агенттер табылған. Олар ерекше патогенді-ең қарапайым және өлшемі өте кішкентай.

8 Вироидтармен жұмыс кезінде 1-тізбекті ДНК-көшірмелі РНК мен комплементарлық тізбек арқылы вироидтың 2-тізбекті ДНК алады. Осы 2-тізбекті ДНК плазмидаға орналасып, клондау үшін E. coli жасушасына беріледі. РНК-полимераза арқылы танылатын промотор геннің оқылуын бастайды.РНК-полимераза матрицалық РНК-ғы ДНК-ң транскрипциясына жауапты. Әдетте, бұл фрагмент ДНК жұп негізден тұрады. Ген сол жақтан оң жаққа, яғни 5 ұштан 3 ұшқа қарай оқылып, терминалдық аймақта тоқтатылады.Промордан кейін транскрипцияның бастаушы сайты, одан кейін геннің негізгі аймағы орналасады. Бактериалды гендер мен жоғарғы сатылы организмдердің геніне тән промоторлық аймақ, қысқа нуклеотидтер қатарынан тұрады. Осындай сәйкестік РНК-полимеразаға сигнал беру нәтижесінде, промоторлық аймаққа орналасып, генді оқи бастайды.

9 AAV Жақында ғылымдар назарын танқалдырған жаңа кейіпкер таным болды. Бұл аденоассоцировты вирус. AAV өзің ерекше қасиеттерімен : тыныш, қарапайымдылығымен танытты. Клеткаға түсу кезінде, ол: клетка иесінің геномына орналасады.Танкаларлығы :ол алғаш кездескен жерге емес, өзінің белгілігі жеріне орналасуы. Қазіргі бар мәлеметтерге сай ол ешқандай ауруларды тудырмайды, сондықтан иммундық жауап оған әлсіз. Ол бөлінетін, тіпті бөлінбейтін клеткаларды да жұқтыра алады. Бір сөзбен, AAV кейбір жеткіліксіздігі бола тұра, вектор үшің мінсіз негіз. Негізгі жеткіліксіздігі – кіші көлемді болуы. AAV-векторына тек аз аймақты енгізе алуымыз, басқа векторларға жеңіледі. Мысалға: лентивектор. Осыдан басқа, AAV дефекті, өзіне жауапсыз вирус. Ол тек аденовируспен жұқтырылған клеткада ғана көбее алады. Бұл культуралды клетканы жұқтыру кезінде кедергі емес, ал гендік терапия үшін бұл вектор тиімді емес. Себебі, организмге керекті генді барлық жерге өзінен-өзі тасымалдай алмайды. Алайды, бұл шаруа өз шешімін тапты және еш көмексіз өздігінен көбее алатын AAV-векторлар ойлап табылды.

10 Ретровирустар Ретровирустар құрамында РНҚ бар зардапты ісік туғызатын вирустар тұқымдастығы. Геномдары бір-біріне ұқсас екі сыңар тізбекті позитивті РНҚ молекулаларынан және осылармен байланысқан кері транскриптазадан тұрады. Вирус бөлшектерінің диаметрі нм липопротеид қабығы бар. Үш тұқымдастық тармаққа: онковирустарға, лентивирустарға және спумави рустарға бөлінеді. Қоздырғышы 1983 жылы анықталған (Л.Монтанье, Р.Галло).Қазіргі күнде АИТВ-инфекция глобальды түрінде таралуда.Инфекцияланған адамдардың саны 50 млн-ға жуық.РНҚвирустар

11 Өмірлік цикл Ретровирустардың геномы оң-тізбекті РНҚ-дан тұрады. Ретровирус қабықшасы зақымдалған жасушаның мембранасынан түзіледі және вирустық ақуыздардан тұрады. Геном репликациясы және вирустардың жинақталуы үшін үш вирустық ген қажет gag, pol және env. Зақымдалған жасушада кері транскриптаза көмегімен вирустық РНҚ матрицасынан қостізбекті ДНҚ (провирус) түзіледі,кейін ол жасушалық геномга орналасады. Бұл процестерді жүзеге асыратын вирустық ақуыздар кері транскриптаза мен интеграза. Провирустың ядроға кіруі үшін митоз барысында жасушаның ядро қабығы бұзылуы қажет. Провирус жасушалық геномға енген соң, жасуша аппаратын вирустық мРНҚтранскрипциясы, процессингі және трансляциясы үшін пайдаланады. Вирустың өмірлік циклі провирус матрицасында жаңа оң-тізбекті РНҚтүзілуімен аяқталады. РНҚ молекласының арнайы тізбектілігі (psi) жинақтау үшін сигнал береді, содан кейін жаңа вирустар жасуша бетінде жинала бастайды.

12 Вектор құрылысы және алынуы. Ретровирусты векторлар сәйкес провирустардан алынады. gag, pol және env гендері жаңа генетикалық материалға орын босату үшін және вирус репродукциясына айналдыру үшін өшіреді ( 5.1 сурет). Ретровирусты векторға бөгде ДНҚ-ның 8000 жұп нуклеотидіне дейін қосылуы мүмкін. Рекомбинантты вирус вирустық мРНҚ-ны синтездей алмайтындықтан, трансфицирленген жасушаларда иммундық жауап тудыратын вирустық ақуыздар синтезі де болмайды деген сөз. Геноммен бірге векторға промотор мен энхансер енгізуге болады, ол трансгеннің тиімді экспрессиясын және тінарнайылылығын қамтамасыз етеді. Ұзын соңғы қайталауларда (LTR) орналасқан вирустық промотор мен энхансерді де пайдалануға болады. Вирусты ақуыздарды кодтайтын және вирус репродукциясын жүзеге асыратын гендерді өшіргеннен кейін, вирус осы ақуыздарды синтездейтін тек арнайы түзілген жасуша линияларын репродукциялауға қабілетті (5.1 сурет). Осы жасушаларлың геномына вирус гендері (gag, pol и env) әртүрлі хромослмада орналасатындай етіп енеді.бұл вирус геномында осы гендердің кері репродукциясын және репродукцияға қабілетті вирустардың түзілу мүмкіндігін төмендетеді.рекомбинантты ДНҚны провирусқа енгізгеннен кейін соңғылары ретровирусты вектор түзе бастайды. Првирус ДНКсын плазмида түрінде енгізеді. Жасуша трансдукциясын стандартты әіспен үзеге асырады. Репродукцияға қабілетті вирус рекомбинациясының түзілу мүмкіндігін төмендету үшін бірнеше модификация ойлап табылды (Jolly, 1994).

13

14

15 Ретровирустардың вирустарын қолдану. А.схемасы Ретровирустардың векторын алу.Репродукцияға қабілетсіз ретровирустық вектор құрастыру үшін синтездеуге қабілетті вирустардың жойылған гендері мен арнайы жасуша линияларын қолданады. Бактериялдық плазмидтердің көмегімен клетка ішіндегі сай келетін линияларға gag (G), pol (P), env (E) гендерін енгізеді. Арнайы вирустық ақуыздарды синтездейтін жасушаларды жинақтаушы (упаковывающий) деп атайды. Жасушаларда вирустарлы құрастыру үшін барлығы бар,сондықтан ретровирустардың векторлары культуральді ортада жинақтала бастайды. Осы векторларда бірнеше трансгендер бар gag, pol, env бірақ олар вирустық гендерден айырылғандықтан, жасушаға жұқпалы ауру жұтқызу кезінде репродукцияға ұшырымайды.

16 Лентивирустар Ретровирустардың туысына жататын вирустар бөлінетін және бөлінбейтін жасушаларды жұқтыра алады (Buchschacher, Jr. and Wong – Staal,2000).Лентивирустардың ішінде ең жақсы зерттелген ВИЧ-1, соның негізінде алынған векторлар теория жүзінде аталған ретровирустарға қарағанда көптеген артықшылықтарымен ерекшелінеді. Әсіресе, бағаналы жасушалардың трансдукциясына қабілеті жоғары (Miyoshi et al.,1999). Осы векторлар трансгеннің ұзақ экспрессиясын қамтамасыз етеді. Лентивирустардық векторлардың пайда болу себебінде, клиникалық зерттеу өткізу барысы алдында, олардың қауіпсіздігіне көз жеткізу керек( Amado and Chen, 1999)

17 Өмір сүру циклы Лентивирустар басқа да ретровирустармен ұқсастығы бар.(Tang et al., 1999). 5´-gag-pol-env-3´. осы реттілікте РНҚ-да орналасқан вирустардың геномында 3 ген болады. Сондай-ақ әр-түрлі вирустардың геномында бір-біріне ұқсамайтын қосымша гендер бар (в случаеВИЧ- 1 это vif, vpr, vpu, tat, rev, nef). Қосымша гендердің өнімділігі (продукция) РНҚ-ның геномындағы репликацияның дұрыс жүруіне қатысады. Қайталанатын ұзын ұштары шамамен 600 нуклеотидтен, Участок U3 450, R 100 және участок U5 шамамен 70 нуклеотид тізбегінен тұрады.

18 Вектор құрылысы және алынуы Лентивирусты векторлар ВИЧ-1 геномынан кейбір қосымша гендердің алынып тастауының арқасында репродукцияға деген қабілетін жоғалтады, сондықтан оларды алу үшін ораушы жасушаларды қолданады. Бұл ораушы жасушаларда тәуелсіз гендер вирусты құрауға қажетті компоненттерді кодтайды (Srinivasakumar and Schuening, 1999). Бұл елеулі түрде векторды алу кезіндегі рекомбинацияның болу мүмкіндігін төмендетеді, нәтижесінде теориялық түрде вирустың репродукцияға қабілеттілігі қалпына келуі мүмкін. Сонымен қатар tat гені мен қайталанатын ұзын ұштардың ( LTR) алынып тасталуы векторды немесе in vivo алу кезінде репродукцияға қабілеттілігінің қалпына келу мүмкіндігін төмендетеді.

19

20 Аденовирустар Аденовирустар құрамында сызықтық қостізбекті ДНҚ бар және қожайын клетка бөліміне тәуелсіз репродукцияға қабілетті болып келеді. Аденовирусты векторлар бирқатар ерекшеліктерге ие және олар клиникалық қолданылуын белсендіреді. Олар гендерді адамның әр түрлі талшықтарына жеткізеді, сонымен қатар демалу жолдарының эпителилеріне, эндотелийге, миокард және қаңқа бұлшық еттеріне, перефириялық және орталық жүйке жүйесі жасушаларына, гепатоциттер, ұйқы безінің экзокринді жасушалары және ісіктердің әр түрлі типтері. Адам аденовирусының 40тан астам серотиптері белгілі, ал олардан туындайтын аурулар нақты көрсетілген (Horwitz, 1990). Аденовирусты векторлар бөлінетін, сонымен қатар бөлінбейтін жасушалардың эффективті трансдукциясын қамтамасыз етеді, кеін трансген экспрессиясы жүреді. Әр түрлі енгізу жолдарын қолдануға болады, мысалы внутрибрюшинный, внутричерепной интротекальный, внутрипузырный. Енгізудің көптүрлілігі ең ыңғайлысын таңдауға мүмкіндік береді. Аденовирусты векторлардың екі кемшілігі бар. Біріншіден, жасушаны жұқтырудан кейін вирусты геном ДНҚ клеткасына орналаспайды,трансгеннің ұзақ мерзімді экспрессиясы жүрмейді. Екіншіден, аденовирусты инфекция клеткалық және гуморальдық звенья иммунитетін белсендіреді, ол трансфирленген жасушалардың жойылуын және ветордын қайталана ену мүмкіндігін төмендетеді.

21 Өмір сүру циклы. Аденовирусты инфекция Коксаки вирусы бар рецептормен және мембранада орналасқан аденовирустардан тұратын икосаэдрлі капсидтің шыңында міндетін атқарушы түптеу жіп бастамасымен басталады. Содан кейін үш аминоқышқылды қалдықтың өзара іс-қимылының бірізділігі болады. Вирусты ДНҚ клетканың ядросына кіреді. Ол жерде вирусты мРнқ-ның синтезі басталады.Вирусты геномның экспрессиясы мен репликациясы арнайы бірізділікпен жүреді. Оны Е1А және Е1В гендері анықтайды.Бұл гендер бірнеше вирусты гендердің трансактивациясын қамсыздандырады. Е1 гендері аденовирустардың репродукциясында қатысады,сондықтан олардың жойылуы репродукцияны шектейді немесе қиындатқызады. Вирустың бүкіл аденовирусты гендерді жою қиынырақ,ретровирусты гендерге қарағанда.

22 Аденовирусты векторды пайдалану. Рекомбинантты аденовирус нысан-жасуша бетінде спецификалық рецепторлармен байланысады және оған эндоцитоз жолымен енеді. Вирусты ақуыздар вирустын эндосомадан лизосомамен бірігуіне дейін шығуын қамтамасыз етеді,вирустың бұзылуына жол бермейді. Аденовирусты ДНҚ ақуыздардан босатылып, ядроға енеді де жаңа мРНҚ синтезі басталады. Трансгені бар аденовирусты ДНҚ қожайын жасуша геномына орналаспайды.

23 ВЕКТОРДЫ АЛУ ЖӘНЕ ОНЫҢ КОНСТРУКЦИЯСЫ. Вектор алу үшін көптеген әйгілі аденовисты серотиптер қолданылады. Оның ішінде 2 және 5 серотипін қолданады. Бірінші ұрпақты аденовирусты векторларды Е1 жәнк Е3 вирус геномынан жою арқылы алған. Осы делециялардан кейін вирус репродукцияға жарамсыз,ал геномға 7500 жұп бөгде ДНҚ енгізуге болады. Аденовирусты векторлардың екінші ұрпағында Е2 және Е4 райондары жойылған.

24

25 Адено ассацирленген вирус Өмірлік циклі. Адено ассацирленген вирус репродукция үшін гендік ақпараты бар көмекші-вирусты қажет етеді. Өмірлік циклінде аденоассацирленген вирустар 2 фазаны қарастырады. Мұндай вирус жасушаны зақымдайды, жасуша геномына қосылып, көмекші-вирус (аденовирус) жоқ болғанда летальды қалыпта ұзақ уақыт сақталып қалады. Ал аденовирус бар болған жағдайда, активті фаза басталады, аденоассацирленген вирустың репродукциясына және жасуша лизисіне алып келеді. Аденоассацирленген вирус гені 2 ашық рамканы оқиды (гер және сар), инвиртирленген соңғы қайталанулармен шектеледі(ITR). Вирустың репродукциясы үшін тек гер гены ғана керек, төрт ақуызды кодтайтын,аденоассацирленген вирустың репродукциясын қамтамасыз ететін, ДНК вирусының транскрипциясын және эндонуклеазды белсенділік үшін және жасуша геномына қосылу үшін. Құрлымдық ақуыздар, вирустың капсидін түзуші, сар генімен кодталады. Инвентирленген соңғы қайталанулар ауданында репликация басталатын нүктелері орналасқан; вирус құралуы үшін бұл қайталануларда сигналдар бар, сонымен қатар клетка геномында ДНК вирусының қосылуы үшін керек. Көптеген ақуыздардың функциясы және көптеген вирустың бирустың ерекшеліктері модифицирленген емес вирустарды зерттеуден кейін белгілі болды. (Kotin,1994).

26 Зақымдану вирустың жасушаның негізгі рецепторына - протеогликанға жабысуымен басталады, құрамында гепарасульфат (summerford and samulski,1998).Вирустың жасушаға кіруі барысында фибробластың өсуі рецепторы бар және ең Р5-интегрин (summerford et al 1999) қатысады. Вирустың интернализациясы клатринмен жабылған эндоцитоз жолымен жүреді.(Burtlett et al.,2000a). Жасуша ішіндегі аденоассацирленген вирустың жасушасы шеңберге бітеледі және шеңберлі контамерлер құрады,xромосомадан тыс тұратын (Yang et al 1999). Вирусты геномның шеңберлі түзілуі трансгеннің ұзақ экспрессиясымен қатар жүреді (Duan et al 1998). Табиғи аденоассацирленген вирус адам ДНК-ң 19-шы xромосомасаның бір учаскесіне енеді. Рекомбинантты вирус кейде бұл қабілетін жұмсайды (Rivadeneira et al 1998). Вектордың алынуы мен құрастырылу. Аденоассацирленген векторларды 3 рекомбинантты плазмидалардың көмегімен алынады (Xiao et al 1998). Бірінші плазмиданың құрамында трпнгені бар, 2 инвертирленген соңғы қайталамалар арасында орналасқан, екінші -гер және сар гендері, үшінші-аденовирус ген учаскелері,аденоассацирленген вирусты құрастыру үшін керек. Бұл жол жасушаның қосымша ауруға ұшырамауына алып келеді. Аденоассацирленген вирустың геномының көлемінің аздығыннан векторға бөгде ДНК-ң 5200 жұп нуклеотидтерді қосуға болады. Бұл тек потенциалды трансгеннің көлемін, сонымен қатар арнайы промотерлер мен энxансерлер көлемін шектейді, ауруға ұшыраған жасушаның экспрессиясын қадағалайды. Екі векторлы системаны қолданғанда вектордың сыйымдылығын 2 есеге арттыруға болады: 2 жарты бөліктері invivo жағдайында біріктіріледі,жасуша ішінде шеңберлі контамерлерге қосылады.(Sun et al, 2000; Yan et al.,2000). Осындай жолмен 2 үлкен ген құрастыруға болады немесе өте маңызды бақылаушы элементтер қосуға болады, бір векторға тым үлкен (Duan et al.,2000). Қазіргі таңда маңызды аденоаасацирленген вирустардың маңызды мәселелерінің бірі векторлардың құрылымы, оның титрының анықтамасында. Нысана-жасушалар. Аденоассацирленген векторлар әртүрлі жасушаларды ауруға ұшыратуға бейім. Зерттеулерде жасушаның бұлшық еттердің ЦНС,өкпе,бсуыр,ЖКТ,көздің эффективті трансдукциясы көрсетілген.

27 Қарапайым 1ші типті герпес вирусы Бұл вирус 2 тізбекті днқ-ның үлкен молекуласынан тұрады. Ол клетканың ядросында репликацияланады. Вирус әртүрлі клеткаларды жұқтырады. Вирусты геном xромосома сыртында орналасады. Вирусты геномға гомологті рекомбинация арқылы немесе делеция жолы арқылы жұп бөтен ДНҚ нуклеотидтерін енгізуге болады. Қарапайым 1ші типті герпес вирусы нейрондарға тропикті болып келеді, сондықтан оны жүйке ауруларының генотерапиясында вектор ретінде пайдалану ұсынылған. Мысалы, Паркинсон ауруы немесе мидың қатерлі ісігі ( Fink and Glorioso, 1997; Simonato et al.,2000). Бұл вектордың негізгі кемшілігі – цитотоксиндігі және трансгендіктің тоқталу мүмкіндігі.

28

29 Өмір сүру циклы. Қарапайым 1ші типті герпес вирусынан туындаған инфекция жасуша лизисіне немесе латенттігіне алып келетін белсенді болуы мүмкін. Бастапқы жұқтыру кезінде вирус эпителий клеткасына еніп, сол жерде репродуцирленеді.Жаңа вирустар зақымдалған клеткадан кету барысында сыртқы қабат пайда болады. Ол клеткалық мембрананың қалдықтарынан тұрады. Кейіннен вирустар біріншілік инфекция ошағына жақын сезімтал жүйкелерге енеді де, нейронның талшықты денесіне ретрогранды түрде транспортизацияланады. Вирустың тіркесуіне клеткалық мембрананың беткі бөлігінде орналасқан гепарансульфат молекулалары қатысады (Laquerre et al., 1998). Нейрон денесіне ену арқылы вирус белсенді репродуциясын жалғастыра алады немесе латентті жағдайға ауысуы мүмкін.

30 ВЕКТОРДЫ АЛУ ЖӘНЕ ОНЫҢ КОНСТРУКЦИЯСЫ. Герпесвирусты вектор құрамында репликацияға қажетті бірнеше геннің жоқ болуына байланысты репликацияға қабілетсіз болып келеді, мысалы ICP4, 1СР22 және ICP27(Krisky et al., 1998). Бұл гендерді жою вектордың цитотоксиндігін азайтып, трансген экспрессиясының ұзақтығын жоғарылатады. Герповирусты векторды алуда вирус-көмекшілердің көмегінсіз жүргізілетін әдістер ойлап табылған болатын. Мұндай векторлар in vivo жүйке клеткаларын зақымдамай жұқтыра алатын қасиетке ие (Fraefel et al., 1996). Қарапайым 1ші типті вирус негізінде вектор алудың ең тиімді әдісі ол 2 тәуелсіз трансгенді қоса жасау (Krisky et al., 1997). Герповирусты векторларды пайдаланудың негізгі кедергісі ол экспрессияның қысқа уақытты болуы. Бұл мәселені шешудің әдісі – ол LAT-транскрипт синтезін активирлеуші промоторларды пайдалану (Goins et al., 1999; Lachmann and Efstathiou, 1997; Marshall et al., 2000).