Геномика и геномная селекция крупного рогатого скота: исследовательские и прикладные задачи Глазко В.И., Глазко Т.Т. РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева vglazko@yahoo.com. - презентация

1 Геномика и геномная селекция крупного рогатого скота: исследовательские и прикладные задачи Глазко В.И., Глазко Т.Т. РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева

2 Рост стоимости продовольствия (ФАО)

3 Монопородность (данные ФАО) Глобальное распространение голштино-фризской породы Индустриализация требует увеличения плотности популяций животных, увеличения доз бактерицидных средств и регуляторов роста; сопровождается сужением биоразнообразия пород, разнообразия используемых агроландшафтов и рыночной продукции животноводства, снижением качества конечной продукции

4 Широкое распространение нарушений воспроизводительной функции высокопродуктивных пород сельскохозяйственных видов животных - одна из основных проблем их оптимального использования и дальнейшего повышения их продуктивности. Так, например, по данным К.В.Племяшова, у черно-пестрого голштинизированного скота выход телят на начало 2009 года составил в среднем 77 голов на 100 коров, а в отдельных хозяйствах – голов. Выбраковка коров, в связи с бесплодием, в последние годы остается на высоком уровне и составляет 31%. Широкое распространение нарушений воспроизводительной функции высокопродуктивных пород сельскохозяйственных видов животных - одна из основных проблем их оптимального использования и дальнейшего повышения их продуктивности. Так, например, по данным К.В.Племяшова, у черно-пестрого голштинизированного скота выход телят на начало 2009 года составил в среднем 77 голов на 100 коров, а в отдельных хозяйствах – голов. Выбраковка коров, в связи с бесплодием, в последние годы остается на высоком уровне и составляет 31%.

5 Исследовательские задачи: 1) Исследования истории и генеалогии пород, их распространения, специфики их генофонда; 2) разработка генетически обоснованных программ устойчивого использования местных пород и их сохранения; 3) картирование главных генов количественных признаков в целях геномной селекции

6 Прикладные задачи: 1)Ошибки происхождения 2) Прогнозы: количества конечной продукции; качества конечной продукции; устойчивости к условиям содержания; устойчивости к инфекционным агентам; отсутствия наследственных заболеваний; отсутствия инфицированности патогенами.

7 Поколения молекулярно- генетических маркеров 1. Отдельные гены - генетика Генотипирование отдельных генов: Группы крови Электрофоретические варианты белков Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ) структурных генов Микросателлиты

8 2) Совокупность всех генетических элементов – геномика Геномные технологии: 1) Полилокусные фрагменты анонимной ДНК, фланкированные инвертированными повторами микросателлитов (Inter-Simple Sequence Repeat - ISSR-PCR), участками мобильных генетических элементов 2) ДНК микроматрицы – десятки тысяч мононуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) 3) Экологическая генетика – ДНК микроматрицы + технологии геоинформационных систем (ландшафтная геномика)

9 Фирма – Прикладные биосистемы ( ms.com) ms.com По согласованию с FAO и ISAG раработала тест-систему для генотипирования 11-ти микросателлитов (необходимы закупка соответствующего оборудования, программ анализа и расходных материалов). Достоинство – известна хромосомная локализация Микросателлиты: TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225, BM1824

10 Геномика

11 Геномные сканирования – главное направление современной эволюционной и популяционной геномики. Геномное сканирование может варьировать от использования нескольких десятков или сотен маркеров до истинного геномного сканирования, путем полного секвенирования геномов.

12 В самых первых ДНК-биочипах Андрея Дарьевича Мирзабекова была реализована технология иммобилизация олигонуклеотидов в очень маленьких кусочках полиакриламидного геля. Затем было придумано раскапывать микрокапли раствора с компонентами для геля и с олигонуклеотидами и проводить фотоактивируемую кополимеризацию. ДНК биочипы

13

14 Компания Affymetrix создала и запустила в продажу биочип, поволяющий идентифицировать присутствие в пище следовых количеств мяса от 12 видов млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 видов рыб. Среди разработок этой компании имеется биочип, позволяющий выявлять мононуклеотидный полиморфизм (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) по 20 тысячам сайтам в различных участках геномов молочных и мясных пород крупного рогатого скота. В этом же направлении успешно работает, например, и компания Bovigen.com, которая создала биочипы для выявления генов, ассоциированных с качественными характеристиками мяса крупного рогатого скота, а также биочипы для контроля происхождения животных.

15 FoodExpert-ID идентифицирует тысячи животных генов (иллюстрация с сайта affymetrix.com). Прибор может идентифицировать биологические следы в пище от 12 разновидностей млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 разновидностей рыбы.

16 Снимок прореагировавшего чипа с большим увеличением. Белые, красные, жёлтые квадратики участки с высокой концентрацией флуоресцентного вещества. Зелёные, синие, чёрные соответственно, со всё более и более с низкой (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

17 Геномное сканирование используется: для определения параметров изменчивости внутри и между породами; для идентификации географической локализации отдельных популяций и/или перемешивания популяций с различным генетическим происхождением; для получения информации об эволюционных взаимоотношениях (филогенетические деревья) и выяснения центров происхождения и маршрутов миграции; для осуществления картирования генов, включая идентификацию носителей известных генов; для установления происхождения и генетических взаимосвязей (напр., ДНК фингерпринт) внутри популяции; для поддержки генетического улучшения популяций животных с помощью маркеров; для создания ДНК хранилищ в целях исследований и хранения генетических ресурсов (FAO, 2005).

18 «Геномная селекция» молочного скота в настоящее время – использование ДНК матриц (ДНК биочипов) для генотипирования около 50 тысяч мононуклеотидных замен (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) для выявления геномных участков, генотипы по SNP которых ассоциированы с желательным проявлением характеристик молочной продуктивности. По сути, является продолжением картирования главных генов молочной продуктивности, начатом в 1990 г с использованием генотипирования сначала десятков, затем сотен микросателлитных локусов (которые продолжаются до сих пор, например, работы Майкла Джорджеса, 1996 – 2010 гг) Одна ДНК микроматрица для 1 животного стоит примерно 200 евро (без учета других расходных материалов, амортизации соответствующего приборного обеспечения и затрат квалифицированного труда для их использования)

19 Термин «геномная селекция» подразумевает следующие этапы: 1) геномное сканирование с использованием десятков тысяч эталонных фрагментов ДНК (ДНК микроматриц) для выявления мононулеотидных замен вдоль генома у разных животных; 2) выделение геномых участков с высокой плотностью SNP, генотипы которых ассоциированы с желательным проявлением совокупности хозяйственно ценных признаков; 3) создание ДНК микроматриц для генотипирования множества SNP, ассоциированных с желательным проявлением хозяйственно ценных признаков (предполагая, что они маркируют главные гены этих количественных признаков); 4) включения результатов такого множественного генотипирования по SNP в оценки племенной ценности с использованием методов геномного сканирования (genomic breeding values - GEBV).

20 Схема взята из Кузнецова В.М. «СТРАТЕГИЯ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИЧЕСК ОЙ ОЦЕНКИ ЖИВОТНЫХ В XXI ВЕКЕ»

21 На 2009 г такой подход был проверен в США, Новой Зеландии, Австралии и Нидерландах на ,500 (в разных странах) голштино-фризских быках, тестированных по потомству, генотипированных по 50,000 SNP. Соответствие прогноза GEBV для юных быков без оценки потомства с далее полученными данными по потомству колебалось от 20 and 67%. Надежность прогноза зависела от генетической компоненты в наследуемости признака, количества исследованных быков, используемых статистических методов обработки данных. Во всех странах подтверждено, что надежность прогноза по GEBV, так же как и по другим признакам, увеличивается при использовании наилучшего линейного несмещенного прогноза (Best Linear Unbiased Prediction - BLUP), в который включается усредненные оценки племенной ценности родителей.

22 На март 2011 года Веллер, Рон – израильские исследователи, которые в начале 90-х годов первые пытались картировать главные гены молочной продуктивности с помощью микросателлитов на хромосомах крупного рогатого скота, уже обсуждают эффективность прямого включения данных по геномному сканированию в селекционные программы для отбора бычков без их оценки по потомству для сокращения среднего интервала между поколениями только по генотипированию критических для QTL молочной продуктивности SNP (actual quantitative trait nucleotides - QTN). Weller J., Ron M. Invited review: quantitative trait nucleotide determination in the era of genomic selection.// J. Dairy Sci. Mar;94(3): Причины сомнений – цена вопроса и факторы, влияющие на «главность» генов количественных признаков: породная принадлежность, факторы окружающей среды.

23 Сеть генов, входящих в соматотропную ось, связанную, в частности, с синтезом бета-эстрадиола. Красным отмечены гены, по которым хотя бы у одной из молочных пород Франции выявлено неслучайное распределение SNP

24 40 таких генов обнаруживают связь с QTL по молочной продуктивности хотя бы у одной из исследованных пород. То есть – гены, ассоциированные с молочной продуктивностью - породоспецифичны

25 Сходные данные были получены нами при генотипировании пород крупного рогатого скота молочного и двойного направления продуктивности по генам, аллельные варианты которых ассоциированы с характеристиками молочной продуктивности (общий удой, процент жира, процент белка и т.д.). Обнаружена выраженная межпородная дифференциация по частотам встречаемости «молочных» аллелей; их частота статистически достоверно выше у молочных пород по сравнению с двойной продуктивностью – однако у индивидуальных молочных животных не обнаруживается сцепления между присутствием желательных «молочных» аллелей по разным локусам.

26 Из этого следует, что критическими генами для реализации желательного признака продуктивности у разных животных могут быть разные гены Хромосомная карта лактома Распределение генов молока и генов молочной железы по всем хромосомам крупного рогатого скота. Каждая из 30 хромосом представлена двумя колонками, в первой указана хромосомная локализация генов молока и молочной железы, во второй - QTL характеристик молочной продуктивности. Гены, участвующие в наработке молока и развитии молочной железы распределены по всем хромосомам.

27 Бельгийские исследователи показали, что оценки племенной ценности быков по молочной продуктивности дочерей голштинской породы существенно отличаются в Люксембурге и Тунисе, причем доля генетической компоненты изменчивости по характеристикам молочной продуктивности выше в Люксембурге, а паратипической – в Тунисе, низки и недостоверны ранговые корреляции одних и тех же быков между оценками, полученными по их дочерям в разных странах Hammami H et al. Genotype x environment interaction for milk yield in Holsteins using Luxembourg and Tunisian populations.//J. Dairy Sci Sep;91(9): ; Environmental sensitivity for milk yield in Luxembourg and Tunisian Holsteins by herd management level.// J. Dairy Sci. – Sep;92(9): ; Accessing genotype by environment interaction using within- and across-country test-day random regression sire models.// J. Anim. Breed. Genet Oct;126(5):

28 ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ Авторы общи й удой % белк а общи й белок % жира общи й жир количество соматически х клеток в мл молока ---2, 15 7Weller J.I. et al., Ron M. et al.,1994 1, 6, 96, 201, 96--Georges M. et al., Spelman R.J.et al.,1996 6, Wiener P et al., Olsen HG et al., , 29-3, 6-3, 14, 29 21Rodriguez-Zas SL et al.,2002 5, , 262, 19Bennewitz J et al., Freyer G, et al., 2003 Результаты картирования QTL молочной продуктивности у голштинов с использованием генотипирования десятков и сотен микросателлитных локусов (сводка литературных данных, цифрами указаны хромосом: суммарно 14 из 29 имеющихся в кариотипе крупного рогатого скота)

29 Однако геномное сканирование, объединенное с геоинформационными системами, выполняют особую роль в выявлении генов устойчивости к средовым факторам (мишеней естественного отбора), особенно в связи с прогнозами изменений климата

30 Степень правдоподобия (в %) того, что будущая средняя летняя температура будет превосходить все зарегистрированные до сих пор максимальные значения температур (A) до 2050 и (B) до Красным отмечены зоны, в которых более 90% вероятности, что будущие средние летние температуры будут превосходить все температурные максимумы, описанные с с 1900 по На 1 градус повышения температуры утрачивается от 2,5 до 16% урожая основных кормовых трав в засушливых районах. Прогноз сделан Давидом Баттисти и Розамонд Найлор на основании 23 глобальных молелей климата, используемых Межправительственной Группой по Климатическим Изменениям

31 Локализация молочных ферм (красный цвет), на которых собирались данные по молочной продуктивности, и станции контроля метеоусловий и климатических характеристик (зеленый цвет). Выявлены достоверные ассоциации между резистентностью к температуре по молочной продуктивности и генотипами по гену фактора контроля роста фибробластов, участвующего в контроле пролиферации эпителия молочной железы, а также резистентности по молочной продуктивности к пониженному уровню кормов и генотипами по глицерол-3 фосфатдегидрогеназы, фермента, участвующего в контроле синтеза липидов (по Ben J. Hayes et al., 2009)

32 Поскольку известно, что в мононуклеотидных заменах (SNP) участвует существенно меньшее количество нуклеотидов (~1/50000 пар оснований) чем в изменчивости по числу копий геномных участков (CNV – делеции, дупликации, транслокации, инверсии - ~1/10000 пар нуклеотидов) в последние годы выполняется геномные сканирования по распределению CNV вдоль хромосом у быков голштинской породы (например, работы того же Веллера и соавторов, в частности: Seroussi E., Glick G., Shirak A., Yakobson E., Weller J.I., Ezra E., Zeron Y. Analysis of copy loss and gain variations in Holstein cattle autosomes using BeadChip SNPs. //BMC Genomics :673..

33 Карта распределений участков полиморфизма по копийности последовательностей ДНК на идиограммах хромосом человека. Зеленые линии отмечают локализацию повторенных участков, связанных с сегментными дупликациями хромосом, голубые – не связанные с такими дупликациями. Длина линий справа отражает размер каждого повтора. Длина лини слева указывает на частоту встречаемости таких повторенных участков среди исследованных 270 геномных ДНК. Данные представлены в базе Database of Genomic Variants (

34 К настоящему времени около быков голштинской породы генотипированы с использованием ДНК микроматриц BovineSNP50 BeadChip компании Illumina, позволяющих генотипировать одновременно 54,001 SNP (~ одна SNP на 50,000 пар оснований). Эти микроматрицы (чипы) позволяют выявить не только сцепленные с SNP маркеры, но и изменчивость по количеству копий соответствующих геномных участков, где локализованы SNP (copy number variations – CNVs, включают делеции, дупликации, транслокации и инверсии). У человека покрывают 12% генома. То есть, изменчивость CNVs вовлекает в себя больше нуклеотидов на геном, чем SNPs. Предполагается, что спонтанные CNV возникают в среднем с частотой 1/10,000 пар нуклеотидов.

35 Программа PennCNV по интенсивности сигнала гибридизации участков исследуемой геномной ДНК с эталонными фрагментами ДНК чипов BovineSNP50 BeadChip позволяет оценивать присутствие/отсутствие CNV (интенсивность сигнала – SI метод). Другой метод – оценивали равновесие распределения аллелей SNP в соответствии с Харди-Вайнбергом, (HWE метод). В качестве контроля оценивали равновесие по аллелям SNP в не псевдоаутосомных участках хромосомы Х. Получены данные о 418 участках с CNV на разных хромосомах, в частности, на хромосоме BTA18, в которой ранее были выявлены участки, полиморфизм которых ассоциирован с изменчивостью по массе и размерам новорожденных телят. В участках увеличения числа копий обнаружена перепредставленность генов, принадлежащих к семейству обонятельных рецепторов (ORs, 36 генов), белков плотных межклеточных контактов (cadherins, 10 генов) и белков - транспортеров (63 генов), среди которых преобладают ABC транспортеры, несущие АТФ- связывающий домен.

36 Карта изменчивости числа копий обонятельных рецепторов на хромосомах быков голштинов, полученная Веллером и соавторами, в сравнении с данными других авторов

37 Результаты геномного сканирования секвенированного генома крупного рогатого скота Белок кодирующие гены ортологи в геномах крупного рогатого скота, собаки, человека, мыши, крысы ((Bos taurus, Canis familiaris, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, представляющие плацентарных млекопитающих), опоссум (Monodelphis domestica, сумчатый), и утконос (Ornithorhynchus anatinus, яйцекладущий). (A) Большинство генов млекопитающих ортологи, больше чем половина которых представлена одной копией (темно-синие); несколько тысяч имеют видоспецифичные дупликации (синие); несколько тысяч утрачены у отдельных видов (оранжевые). Зеленым указаны утраченные ортологи и те, которые являются уникальными (белый цвет)]. Розовым представлены ортологи, специфичные для плацентарных. (B) Диаграмма групп ортологов (дуплицированные гены учитываются как один ген) у крупного рогатого скота, человека, грызунов (мышь и крыса), и у неплацентарных млекопитающих (опоссум и утконос) на основе присутствия гена в по крайней мере одном из видов. (C) Распределение ортологов у человека и других видов. (D) максимально вероятное филогенетическое дерево, построенное по ортологам соответствует принятой филогении, относительные темпы молекулярной дифференциации выражаются как длины ветвей. Tellam R. L., Worley K. C. The Genome Sequence of Taurine Cattle: A Window to Ruminant Biology and Evolution//Science. – – Vol – P. 522 – ген ассоциирован с доместикацией, у КРС увеличена копийность ряда генов, связанных с иммунной системой, в районах сегментных дупликаций увеличена плотность провирусной ДНК, ретротранспозонов.

38 Функциональная геномика - ДНК чипы позволяют увидеть днамику экспрессии 212 генов, тесно связанную с лактацией Распределение генов, экспрессия которых меняется в связи с лактацией, по функциональным классам. Большинство из них кодирует ферменты общего метаболизма, белки регуляторы иммунного каскада, транспортные белки, а также белки – регуляторы транскрипции и передачи сигнала.

39 Создание ДНК биочипов для анализа профилей генной экспрессии принципиально не отличается от тех, которые используются для выявления SNP – с фрагментами эталонной ДНК, с которой гибридизуется/не гибридизуются фрагменты экспериментальной ДНК, меченные флюорохромами. Экспериментальная ДНК готовится на основании мРНК (с полиаденилированными 3 хвостами – зрелая матричная РНК), к которой прикрепляются флюорохормы с полиТ и выполняется РНК- зависимый синтез ДНК копии этой матричной РНК. Затем совокупность кДНК гибридизуется с ДНК микроматрицей, благодаря чему получают данные о том, какие именно гены в данной клеточной популяции дают спектр матричных РНК.

40

41 Далее этот метод используют для решения задач функциональной геномики (выявление модулей генной экспрессии) Профили генной экспрессии являются генетико- биохимической основой физиологической функции каждого органа млекопитающих. Их изменения тесно связаны с развитием различных патологий. Для того, что бы иметь возможность выявить «критические» гены органоспецифических функций, генетико-биохимические основы различных заболеваний и, соответственно разрабатывать методы их коррекции, необходимо наличие данных о физиологической норме таких профилей.

42 Пример – сравнительный анализ профилей генной экспрессии в печени и почках свиней Первичные данные по профилям генной экспрессии получены в лаборатории биотехнологии профессора С. Фаренкруга, Университет Миннесоты, США Чип 17 Liver Kidney Чип 21 Liver Kidney Чип 25 Liver Kidney Чип 29 Liver Kidney ячеек/спотов

43 Отличия в экспрессии генов хорошо согласуются с отличиями в физиологических функциях и гистологических особенностях органов: одна из основных функций почек - поддержании ионного баланса в крови; клетки печени отличаются от клеток почек морфологией митохондрий и плоидностью гепатоцитов – различия в полиплоидизации совпадают с выявленной нами контрастной в этих органах экспрессией гена, участвующего в контроле цитокинеза (клеточного деления). Основные отличия в профилях генной экспресси клеток почек от печени: -гены, контролирующие меж- и внутриклеточный ионный обмен - гены, контролирующие механизмы клеточного деления

44 Пример - схема взаимосвязей между клеточными путями синтеза и секреции, регулирующими синтез молочного жира в молочной железе крупного рогатого скота (Bionaz M., Loor J. J. Gene networks driving bovine milk fat synthesis during the lactation сycle// BMC Genomics 2008, 9:366)

45 Сетевые взаимоотношения между генами, участвующими в синтезе молочного жира ( Красные кружки отмечают положительные изменения, зеленые – негативные в экспрессии на 60 относительно -15 дня. Красные, голубые и зеленые стрелки отмечают гены, транскрипция которых находится под контролем SREBF1, SREBF2, и PPARG, соответственно. Светло оранжевые стрелки объединяют сеть, включающую PPARG, PPARGC1A, LPIN1, INSIG1, и SCAP, которая контролирует экспрессию/функцию SREBF белков. Буквы между стрелками отмечают действия на активность (A), экспрессию (E), локализацию (LO), протеолиз (L), РНК связывание (RB), белок-ДНК связывание (PD), и белок-белок связывание (PP). Гены сгруппированы по их исходным функциям в синтезе молочного жира.

46 Поиск ДНК маркеров главных генов хозяйственно ценных признаков с использованием генотипирования отдельных локусов (единичных, десятков, сотен микросателлитов, геномного сканирования десятков тысяч SNP, CNV не позволил получить надежных результатов, качественно облегчающих оценки племенной ценности животных и прогноз продуктивности их потомства, но зато – создал новую область исследований – генетику качества конечной продукции

47 Полиморфизм структурных генов, прямо связанных с продуктивностью животных Полиморфизм генов, кодирующих белки молока Фрагменты гена каппа-казеина разных генотипов после обработки рестриктазой Hinf I. 1– гомозиготное животное с генотипом ВВ (размер фрагментов 133, 91 и 49 п.н.); 2-гетерозиготное животное с генотипом АВ (фрагменты 224, 133, 91 и 49 п.н.); 3 – нерестрицированный продукт ПЦР (273 п.н.).

48 Электрофореграмма нативного препарата и Pst I- фрагментов ДНК гена каппа-казеина у лебединской породы крупного рогатого скота: 1, 2, 5 – генотип ВВ; 3, 4, 6 – генотип АА; 7 – генотип АВ; 8 – амплифицированный фрагмент гена каппа-казеина; 9 – маркер молекулярных масс (Step Ladder, 50 bp, Sigma).

49 Сыропригодность молока коров лебединской породы с разными генотипами по локусу -Cn Показатель Генотип по локусу -Cn АААВВВ Массовая доля жира, % Массовая доля белка, % Массовая доля казеина, % Доля казеина в общем белке молока, % Дисперсность казеина: масса мицелл (х10 8 од. мл.массы) диаметр мицелл (х10 -8 м) Продолжительность сычужного свертывания: фаза коагуляции, с фаза образования геля, с суммарная, с Класс по бродильной пробе Класс по сычужно-бродильной пробе Доля животных с казеиновым сгустком: плотным мягким дряблым, хлопьевидным 3,80 3,30 2,57 77,88 3,19 9,16 385,00 363,2 748,2 2,0 – 100 – 3,87 3,34 2,64 79,04 2,69 8,66 347,3 320,3 649,6 1,4 1, – 4,21 3,52 2,89 82,10 2,31 8,23 320,2 213,6 533,8 1,0 100 –

50 Распределение аллелей и генотипов каппа- казеина у разных пород крупного рогатого скота Породные группы Частоты генотипов (%)Аллельные частоты Количество животных АА АВ ВВАВ Голшт.Днепропеторвск ,7920,20840 Голшт.Днепропетровск ,8950,10546 Голшт. Аскания –Нова ,7070,29333 Голшт. Новошепеличи ,6130,38731 Серая украинская , Красная горбатовская ,5310,46922 Красная горбатовская ,4330,56716 Красная горбатовская ,4920,50861 Ярославская ,4210,57952 Костромская ,5960,40452 Красная степная334270,6280,37170 Черная уэльская247240,6030,39740

51 ПородыКоличество животных Аллель C, % Аллел ь G, % Ангусы Лимузины Шароле Симмент алы Другие Суммарн о Распределение аллелей кальпастатина (CAST) – ингибитора кальпаинов, активность которых определяет постубойную нежность мяса, у пород крупного рогатого скота

52 ДНК маркеры носителей рецессивных мутаций, огомозигочивание которых (при накоплении потомков выдающихся производителей) приводит к гибели потомства – например, BLAD

53 ПЦР NN NN NB NB NN NB 132 п.н. 87 п.н. 68 п.н. 45 п.н. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР фрагмента гена CD-18, обработанного рестриктазой Hae III. Генотип здоровых животных (NN) представлен фрагментами гена CD18 длиной в 87 и 45 п.н.; гетерозиготы по носительству BLAD мутации (NB) – длиной в 87, 68, 45 и 19 п.н.

54 Использование линий одних и тех же производителей увеличивает вероятность накопления в поколениях одних и тех же рецессивных неблагоприятных мутаций и их огомозигочивания Поколения

55 ДНК идентификация встройки провирусной ДНК ретровирусов в геном крупного рогатого скота на примере вируса бычьего лейкоза (BLV)

56 Подбор оптимальных условий PCR с праймерами к вирусному гену env. Как матрица использовалась ДНК, выделенная из культуры клеток эмбриональных почек ягнят (FLK), инфицированная BLV. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 3% агарозе: маркер - Puc 19, рестрицированный Hae III (4, слева направо); продукт амплификации гена env (1-3). Тестирование поголовья КРС методом PCR на присутствие провирусной ДНК BLV в геноме. Использованы праймеры к вирусному гену Env. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 1.5% агарозе: маркер молекулярных масс - Рuс 19, рестрицированный Sau3A (15, 31, слева направо); животные, исследованные на присутствие провирусной ДНК в геноме (1-14; 17-29); продукт PCR, полученный на ДНК из культуры клеток FLK (16, 32)

57 Геномика в наномасштабе – метод сбора данных об организации геномов и их отличиях Рассмотрены особенности генетической дифференциации доместицированных (6 видов, 12 пород, 20 внутрипородных групп) и диких видов (12) копытных на основе исследований полилокусных спектров продуктов амплификации, полученных с использованием в качестве праймеров 15-ти следующих фрагментов ди- и тринуклеотидных микросателлитных локусов: (GA)9C, (AG)9C, (AC)9T, (AGC)6T, (TGC)6A, (AGC)6G, (ACC)6G, (GCT)6A, (GAG)6C, (TCG)6G, (CTC)6A, (CAC)7A, (CTC)6C, (GTG)7C, (CAC)7T. Эти же праймеры использовались для анализа спектров продуктов амплификации у сортов пшеницы, культурных и диких видов сои.

58 Спектры амплификации ДНК крупного рогатого скота серой украинской породы, полученные методом ISSR- PCR при использовании праймера (ACC)6G (слева) и пород овец (справа). Дорожки 1,9 – маркер молеку- лярного веса; дорожки 2-5 – спектры ДНК коров; дорожки 6-8 – спектры ДНК быков. Спектр продуктов амплификации у представителей рода Ovis при использовании праймера (AG) 9 C: 1-4 кулундинская овца; 5-8 асканийский многоплодный каракуль; 9 маркер молекулярных масс.

59 Наибольшее количество продуктов амплификации у разных видов получается при использовании в качестве праймеров фрагментов пурин/ пиримидиновых последовательностей (ди-, тринуклеотидные микросателлиты GA, АG, GAG, CTC). Для участков ДНК, фланкированных такими инвертированными повторами, отмечается и наибольший консерватизм по длинам продуктов амплификации, полученным на геномной ДНК различных видов. Накопленные данные свидетельствуют о наличии неслучайности распределения фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором участка микросателлитного локуса в зависимости от их нуклеотидных последовательностей, принадлежности к пурин/пиримидиновым трекам

60 Обнаружено, что микросателлитные локусы с относительно повышенной частотой позиционированы в геноме с последовательностями ретротранспозонов

61 Comparative compositions of trinucleotide simple sequence repeats (SSRs) in four mammalian species Tellam R. L., Worley K. C. The Genome Sequence of Taurine Cattle: A Window to Ruminant Biology and Evolution//Science. – – Vol – P. 522 – 528 Выявленный нами высокий уровень полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором микросателлита AGC у крупного рогатого скота и овец соответствует литературным данным (Tellam et al., 2009) о «перепредставленности» AGC повтора в геномах этих видов по сравнению с другими видами млекопитающих (в 90- и в 142- раза чаще в геноме крупного рогатого скота по сравнению с геномами человека и собаки, соответственно). В геноме крупного рогатого скота 39% микросателлитных локусов с кором AGC ассоциированы с ретротранспозоном Bov-A2 SINE, эволюционно молодым и видоспецифичным для генома крупного рогатого скота

62 Продукты амплификации фрагментов геномной ДНК крупного рогатого скота с использованием праймера к LTR району транспозона сои SIRE-1 (номер по каталогу AF053008). Дорожки 1-4, 5-10 – образцы ДНК черно-пестрых голштинизированных животных экспериментального хозяйства «Новошепеличи»; дорожки – образцы ДНК крупного рогатого скота лебединской породы (для сравнения), М – маркер молекулярных масс.

63 Для того, чтобы оценить возможность локализации в геноме крупного рогатого скота участков ДНК, гомологичных LTR транспозона сои, с использованием программы BLASn нами выполнен соответствующий поиск в ГенБан секвенированных последовательностей. Участки с частичной гомологией (11 – 23 нуклеотида) обнаруживаются в секвенированных последовательностях 20 из 29 аутосом крупного рогатого скота, а также в хромосомах Х и У. В базе экспрессирующихся последовательностей крупного рогатого скота участки гомологии выявляются, в основном, в мРНК факторов регуляции транскрипции, мембранных сигнальных белков и белков-рецепторов клеток иммунной системы. Короткие участки гомологии обнаруживаются в ряде микроРНК, экспрессирующихся в геноме крупного рогатого скота: bta-mir-2303 (хромосома 12); bta-mir-2356 (хромосома 2); bta-mir-2480 (хромосома 9); bta- mir-2441 (хромосома 5). Известно, что микроРНК широко представлена в разных геномах, участвует в регуляции генной экспрессии и в определенной степени ассоциирована с защитой от вирусных инфекций.

64 С использованием программы BLASn нами выполнен также соответствующий поиск в ГенБан секвенированных последовательностей крупного рогатого скота гомологичных последовательностей к фрагментам ретротранспозон- подобных элементов семейства R173, в частности, PawS5 и PawS5, по которым нами был выявлен широкий полиморфизм у сортов риса и регенерантов пшениц. В секвенированных последовательностях генома крупного рогатого скота обнаружено большое количество участков с частичной гомологией к этим последовательностям, как правило, локализованным в участках локализации полигенного семейства P450 и генов, связанных с функцией иммунной системы, факторов регуляции транскрипции. Участки гомологии к этим флангам членов семейства R173 имеют несколько более широкую таксономическую представленность, чем фланг ретротранспозона сои.

65 Сравнительный анализ длин ампликонов у доместицированных и диких видов Ungulata, полученных при использовании в качестве праймеров декануклеотидов (RAPD-PCR) и фрагментов микросателлитных локусов (ISSR-PCR) ВидыДлины ампликонов Короткие ( bp,%) Средние ( bp, %) Длинные ( bp,%) ISSR-PCR Доместици рованные 46,743,010,3 Дикие40,743,715,6 RAPD-PCR Доместици рованные 36,350,912,8 Дикие29,849,021,2 У исследованных диких видов полорогих, в общем, больше длинных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором либо декануклеотида, либо микросателлитного локуса, чем у родственных им доместицированных животных. Фрагменты короткой длины чаще встречаются в геномах доместицированных видов.

66 Генофонды доместицированных видов имеют общие черты («популяционно-генетические признаки доместикации»), связанные с адаптацией к экзогенным субстратам и, по- видимому, взаимодействуют с широким спектром разнообразных патогенов-симбионтов в процессе колонизации новых ниш обитания вместе с человеком

67 Ключевым белком фолдинга хроматина является белок CTCF (Cuddapah S., Jothi R., Schones D. E. et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains// Genome Research. – – Vol. 19:. – P.24–32) Последовательность, включающая около 30 пар оснований GA богатого мотива, является одной из основных мишеней связывания белка CTCF, этот мотив представлен во множестве районов, в частности, генома человека ( Ottaviani A, Schluth-Bolard C, Rival-Gervier S. et al. Identification of a perinuclear positioning element in human subtelomeres that requires A-type lamins and CTCF EMBO J. – – Vol.28? N.16, P ). Ottaviani ASchluth-Bolard C Rival-Gervier S Выявленная нами эволюционная консервативность участков ДНК, фланкированных инвертированными повторами, в частности, GA, может отражать их участие в эволюционно консервативной организации генных модулей, включающих гены - организаторы и гены – исполнители.

68 Методы геномного сканирования позволяют обнаружить неслучайное геномное распределение коротких последовательностей ДНК (10 – 20 нуклеотидов, ~10 – 20 нм) и их инвертированных повторов в геномах разных видов. У доместицированных видов полорогих плотность распределения таких последовательностей выше, чем у близкородственных диких. Закономерности распределения таких коротких фрагментов зависят от их нуклеотидных последовательностей, консервативность распределения у полорогих выше для нуклеотиных последовательностей, принадлежащих к пурин/пиримидиновым трекам, способным образовывать трицепочечную ДНК и служить мишенями для связывания белков – факторов регуляции транскрипции, а также фолдинга (укладки) хроматина. Распределение таких коротких последовательностей тесно связано с геномным позиционированием мобильных генетических элементов, в частности, у крупного рогатого скота с распространением в геноме видоспецифичного семейства ретротранспозона с преимущественной локализацией в участках сегментных дупликаций. В секвенированных последовательностях генома крупного рогатого скота обнаруживаются участки гомологии к ретротранспозонам таких кормовых культур как соя, пшеница, рис Полученные данные позволяют предполагать непосредственное участие мобильных генетических элементов в геномной эволюции, в частности, доместицированных видов животных

69 Девять из 10 клеток в нашем организме принадлежат микробам. Только в кишечнике человека присутствует не менее 1000 видов, которые приносят многоклеточному организму в 100 раз больше генов, чем у него есть в собственном геноме. Предпринят большой проект по секвенированию (Проект микробиоты человека) видов микробиоты в кишечнике, на коже, во рту, носу и в женском урогентитальном тракте, благодаря которому уже секвенировано 500 соответствующих микробных геномов из 3000 запланированных. ELIZABETH PENNISI Bodys Hardworking Microbes Get Some Overdue Respect//SCIENCE VOL DECEMBER МЕТАГЕНОМ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ

70 Игорь Анатольевич Тихонович – директор Института сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург) ведет поиск штаммов микробиоты рубца и разрабатывает биопрепараты для увеличения оплаты корма у крупного рогатого скота