Определение источника возникновения MDR-изолятов на основе анализа лекарственно-устойчивых штаммов M.tuberculosis в Новосибирской и Томской областях Лаборатория. - презентация

1 Определение источника возникновения MDR-изолятов на основе анализа лекарственно-устойчивых штаммов M.tuberculosis в Новосибирской и Томской областях Лаборатория молекулярной биологии туберкулеза НИИ биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор»

2 Актуальность проблемы: Около трети населения нашей планеты инфицировано туберкулезом. В течение нескольких последних лет постоянно увеличивается количество больных, инфицированных MDR-штаммами M.tuberculosis Заболеваемость туберкулезом в Новосибирской области составляет 125,4 на 100 тыс. населения, что в 1,41 раза выше общероссийского уровня. Не выявлен основной механизм распространения MDR-штаммов в популяции больных туберкулезом.

3 Возможные механизмы распространения MDR – штаммов M.tuberculosis Поскольку у M.tuberculosis не обнаружены плазмиды и отсутствует механизм обмена ДНК между штаммами, единственной причиной возникновения лекарственной устойчивости являются спонтанные хромосомные мутации. Таким образом остается 2 основных механизма: Селекция спонтанно возникающих мутантных микобактерий в результате неадекватного лечения больного туберкулезом либо при несоблюдении курса лечения больным. Инфицирование больного извне резистентными мутантными микобактериями.

4 Для выявления доминирующего пути в распространении устойчивых штаммов M.tuberculosis мы планировали: Провести детекцию мутаций в генах rpoB и katG с помощью биочипов, производства Московского института молекулярной биологии РАН. Провести детекцию мутаций в генах rpoB и katG с помощью биочипов, производства Московского института молекулярной биологии РАН. Провести генотипирование популяции M.tuberculosis из Новосибирской области методом IS 6110 Inverse PCR. Провести генотипирование популяции M.tuberculosis из Новосибирской области методом IS 6110 Inverse PCR. Провести генотипирование популяции M.tuberculosis из тюрем Томской области методом MIRU-VNTR. Провести генотипирование популяции M.tuberculosis из тюрем Томской области методом MIRU-VNTR. Выявить наличие корреляции между определенной мутацией и принадлежностью изолята к определенному кластеру. Если взаимосвязь существует, то это говорит в пользу распространения MDR штаммов по пути инфицирования извне. Если взаимосвязь не обнаружится, то это значит, что образование MDR-штаммов идет по пути спонтанного мутагенеза. Выявить наличие корреляции между определенной мутацией и принадлежностью изолята к определенному кластеру. Если взаимосвязь существует, то это говорит в пользу распространения MDR штаммов по пути инфицирования извне. Если взаимосвязь не обнаружится, то это значит, что образование MDR-штаммов идет по пути спонтанного мутагенеза.

5 Определение мутаций в генах rpoB и kаtG методом гибридизации на биочипе Наработка анализируемого фрагмента ДНК с помощью ПЦР. Гибридизация реакционной смеси на биочипе. Детектирование флуоресцентных сигналов после гибридизации. Обработка сигналов, выявление доминирующих мутаций.

6 Принцип метода генотипирования 6110 Inverse PCR: Особенностью этого метода является то, что праймеры подбирают к фланкирующим районам IS6110 в такой ориентации, чтобы амплифицировались фрагменты между соседними инсерционными элементами IS6110.

7 Метод MIRU-VNTR Variable Number of Tandem Repeats – Frothingham et al Mycobacterial Interspersed Repetitive Units – Supply et al

8 Спектр мутаций в гене rpoB, выявленных от 170 больных туберкулезом на территории Новосибирской области

9 Генотипирование 170 изолятов из Новосибирской области методом IS6110 inverse PCR Изоляты, входящие в 6-ой и 5-ый кластеры, представлены двумя наиболее распространенными в Новосибирской области генотипами и обладают более высокой трансмиссивностью по сравнению с некластеризующимися изолятами. Изоляты, образующие кластеры, которые состоят не более чем из 6 изолятов на наш взгляд, обладают недостаточной способностью к распространению в Новосибирской области либо могут быть завезенными штаммами. Изоляты, образующие кластеры, которые состоят не более чем из 6 изолятов на наш взгляд, обладают недостаточной способностью к распространению в Новосибирской области либо могут быть завезенными штаммами.

10 Спектр мутаций, выявленных в генах rpoB и katG у изолятов от больных из тюрем Томской области Ген katG Ген rpoB

11 Результат генотипирования 51 изолята из тюрем Томской области методом MIRU-VNTR Среди изолятов идентифицировано 28 генотипов. Процент кластеризации составил 63%, а максимальный размер кластеров не превышал 5 изолятов. Все проанализированные изоляты образуют 4 близкородственные группы, состоящие из 27, 13, 8 и 3 изолятов.

12 Сравнительная характеристика доминирующих путей возникновения MDR изолятов Для определения механизмов распространения MDR-штаммов M.tuberculosis нами были проанализированы частоты встречаемости мутаций генов rpoB и katG в кластерах, обнаруженных при анализе 170 изолятов из Новосибирской области, и 51 изолята, полученного из бактериологической лаборатории УИН Томской области. Для определения механизмов распространения MDR-штаммов M.tuberculosis нами были проанализированы частоты встречаемости мутаций генов rpoB и katG в кластерах, обнаруженных при анализе 170 изолятов из Новосибирской области, и 51 изолята, полученного из бактериологической лаборатории УИН Томской области. Статистический анализ достоверности различия средних значений осуществляли с помощью критерия Стьюдента с φ-преобразованием Фишера и поправкой Йетса на непрерывность. Статистический анализ достоверности различия средних значений осуществляли с помощью критерия Стьюдента с φ-преобразованием Фишера и поправкой Йетса на непрерывность.

13 В результате анализа достоверности различия частот появления мутаций Ser531 Leu в гене rpoB в популяции больных из Новосибирской области, нами установлено: 1. Частота появления мутаций среди кластеризующихся штаммов M.tuberculosis (66,7%, кластер 2, рис.1) достоверно выше, чем частота у некластеризующихся изолятов (35,9%, кластер 1, рис.1), устойчивых к рифампицину. 2. Частоты встречаемости мутации Ser531 Leu у изолятов двух доминирующих кластеров 5 и 6 на рис. 1 достоверно выше, чем частоты как у кластеризующихся изолятов (кластер 2), так и в среднем по выборке и составляют 85,7% и 77,7% соответственно. 3. Сравнение частот встречаемости мутации Ser531 Leu у изолятов двух доминирующих кластеров 5 и 6 не выявил достоверных отличий.

14 В результате анализа достоверности различия частот появления мутаций Ser531 Leu в гене rpo B, и Ser315 Thr в гене katG в популяции, генотипированной методом MIRU VNTR, нами установлено: 1. Достоверных различий между частотами выявления мутации Ser531 Leu в гене rpoB в различных кластерах не было выявлено. 2. Частота встречаемости мутации Ser315 Thr в гене katG достоверно выше в кластере 4 рис. 2, чем в среднем в популяции и составляет 96,4%.

15 Результаты использования биочипов для определения устойчивости к рифампицину и изониазиду. В 85-87% случаев выявление мутации у изолята M.tuberculosis совпадало с наличием устойчивости, определенным с помощью метода ингибирующих концентраций. В 85-87% случаев выявление мутации у изолята M.tuberculosis совпадало с наличием устойчивости, определенным с помощью метода ингибирующих концентраций. Спектр мутаций в гене rpoB как в Новосибирской, так и в Томской областях ограничен и включает в себя 4 основных мутации с явным доминированием мутации Ser 531 Leu Спектр мутаций в гене rpoB как в Новосибирской, так и в Томской областях ограничен и включает в себя 4 основных мутации с явным доминированием мутации Ser 531 Leu Мы рекомендуем внедрить технологию биочипов в клиническую практику как экспресс метод определения устойчивости к рифампицину и изониазиду Мы рекомендуем внедрить технологию биочипов в клиническую практику как экспресс метод определения устойчивости к рифампицину и изониазиду

16 Анализ полученных результатов. Во всех выявленных кластерах нами были обнаружены мутантные штаммы. Видимо, в ходе лечения больных туберкулезом постоянно происходит селекционный отбор устойчивых штаммов M.tuberculosis, образовавшихся в результате спонтанного хромосомного мутагенеза. Во всех выявленных кластерах нами были обнаружены мутантные штаммы. Видимо, в ходе лечения больных туберкулезом постоянно происходит селекционный отбор устойчивых штаммов M.tuberculosis, образовавшихся в результате спонтанного хромосомного мутагенеза. Выявленная связь между кластерами и частотами детектирования мутаций как в гене rpoB, так и в гене katG говорит о преобладающей роли инфицирования первично резистентными микобактериями в распространении MDR – штаммов. Выявленная связь между кластерами и частотами детектирования мутаций как в гене rpoB, так и в гене katG говорит о преобладающей роли инфицирования первично резистентными микобактериями в распространении MDR – штаммов.

17 Данная работа создана коллективом авторов: *Сивков А.Ю., *Болдырев А.Н., *Азаев М.Ш., *Боднев С.А., **Медведева Е.В., **Баранова О.И., **Ивлев- Дунтау А.П., ***Блинова Л.Н., ****Пасечников А.Д., *Татьков С.И. * Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор, Кольцово, Новосибирская область, Россия **НМУ СМО «ФТИЗИАТРИЯ», г. Новосибирск, ул. Петропавловская, 8, *** УИН Томской области **** НГО "Партнеры во имя здоровья", Гарвардская Медицинская Школа, Томск, Россия. Работа поддержана проектами МНТЦ #2019 и #1980

18 Благодарю за внимание.