Прогностическое значение ультраструктурного исследования сперматозоидов при нарушениях фертильности мужчин Брагина Е.Е. Курило Л.Ф. Кущ А.А. Гусак Ю.К. - презентация

1 Прогностическое значение ультраструктурного исследования сперматозоидов при нарушениях фертильности мужчин Брагина Е.Е. Курило Л.Ф. Кущ А.А. Гусак Ю.К. Шилейко Л.В. Бочарова Е.Н.

2 Сперматогенез Сперматогонии Сперматоцит I порядка (2n) Сперматоциты II порядка Сперматиды (n) Зрелые сперматозоиды Митоз 1-е деление мейоза 2-е деление мейоза

3 Сперматогонии, сперматоциты и сперматиды в клетках сертоли

4 Структура нормального сперматозоида Спермиогенез (по de Kretser, Kerr, 1988) Акросома Конденсированный хроматин Шейка Митохондрии Аксонема жгутика Типичный сперматозоид. Растровый электронный микроскоп.

5 Строение соединительного участка жгутика сперматозоида Остаток дистальной центриоли Проксимальная центриоль

6 Структура жгутика типичного сперматозоида Продольный (вверху слева) и поперечный (внизу слева) срезы через жгутики типичных сперматозоидов

7 Дифференциальная диагностика генетически обусловленных и неспецифических форм патоспермии

8 Аномалии строения сперматозоидов, которые могут иметь генетическую природу 1. Первичная цилиарная дискинезия у мужчин с астенозооспермией. Поражаются структуры аксонемы (микротрубочки, динеиновые ручки). Кандидатные гены - DNAH5, DNAH11, DNAI1 и др.. 2. Дискинезия фиброзного слоя у мужчин с астенозооспермией. Разрушение вертикальных столбиков и поперечных ребер фиброзного слоя. Кандидатные гены – гены семейства AKAP. 3. Глобулозооспермия у мужчин с тератозооспермией. Агенез акросомы. Кандидатные гены - GOPC, Ck2. 4. Синдром ацефалических сперматозоидов у мужчин с тератозооспермией. Аномалия базального тельца. 5. Локальное или тотальное отсутствие митохондрий в среднем отделе жгутика. Кандидатный ген – Hst локус t комплекса.

9 Агенез акросомы и деконденсированный «незрелый» хроматин у пациентов с глобулозооспермией Гранулярный «незрелый» хроматин Тотальный агенез акросомы в сочетании с незрелым хроматином и округлой формой головки (глобулозооспермия). Обнаружен у 2% пациентов с нарушением фертильности.

10 Первичная цилиарная дискинезия у пациентов с тотальной астенозооспермией Поперечные срезы через средний отдел атипичных жгутиков сперматозоидов из эякулята пациентов с тотальной астенозооспермией. Прогноз фертильности неудовлетворительный. Пациенты с первичной цилиарной дискенезией составляют около 2% всех пациентов с астенозооспермией. Отсутствуют динеиновые ручки периферических дуплетов микротрубочек аксонемы жгутика Отсутствует центральная пара микротрубочек аксонемы жгутика

11 Жгутик нормального сперматозоида (слева) и жгутик сперматозоида пациента с тотальной астенозооспермией, вызванной дисплазией фиброзного слоя жгутика (справа). Кандидатные гены – гены семейства AKAP Фиброзный слой

12 Поперечные срезы проксимальной центриоли жгутика типичного сперматозоида (слева) и центриоли с разрушенными триплетами (справа - стрелки)

13 Характеристика специфической «синдромной» патологии сперматозоидов 1. Атипия носит либо тотальный характер, либо составляет абсолютное большинство в клеточной популяции образца. 2. Количество сперматозоидов с атипичным фенотипом не корректируется после лечения. 3. Отмечается семейный характер атипичного фенотипа сперматозоидов. 4. Аналогичный атипичный фенотип может быть обнаружен у других пациентов с той же патологией. Причиной «синдромной» патологии, по- видимому, являются точечные мутации, не связанные с изменениями кариотипа.

14 Выявление неспецифической патоспермии при идиопатическом нарушении фертильности мужчин

15 Характерные черты «неспецифической» патоспермии 1)гетерогенность атипий сперматозоидов; 2) отсутствие семейного характера атипичного фенотипа; 3) возможность терапевтической коррекции. Неспецифическая патоспермия часто является результатом цитотоксического действия андрологических заболеваний, либо других эндогенных или экзогенных факторов. Количественные значения параметров патоспермии определены у пациентов фертильной группы, содержание сперматозоидов с различными типами аномалий повышается у пациентов с нарушением фертильности.

16 Неспецифическая патозооспермия у пациентов с идиопатическим нарушением фертильности 1) повышенное содержание сперматозоидов с нарушением конденсации хроматина (35% пациентов); 2) гипоплазия и деградация акросомы (14% и 16% пациентов, соответственно); 3) гиперпродукция мембран ядерной оболочки в постакросомальном районе головки и формирование аутосом в цитоплазматической капле сперматозоидов (18% пациентов); 4) наличие отечных митохондрий с электронно-прозрачнгым матриксом и вакуолизированными кристами в среднем отделе жгутика и нарушение укладки митохондрий (18% и 7% пациентов, соответсвенно); 5) нуклеокапсиды вируса простого герпеса обнаружены в сперматозоидах 7% пациентов с нормозооспермией в сперматозоидах, у 6) колонии микроорганизмов, часто окруженные мембранными структурами выявлены у 9% пациентов. Нормозооспермия определена у 28% пациентов.

17 Нарушение конденсации хроматина более чем в 30% сперматозоидов может быть причиной идиопатического бесплодия при нормальных показателях спермограммы, приводить к спонтанным абортам в первом триместре при беременности с естественным.зачатием. При использовании метода SUZI и ИКСИ снижается частота оплодотворения. Выявлено у 35% пациентов с идиопатическим бесплодием.

18 Аномалия морфологии акросомы вызывает нарушение пенетрационной функции Гипоплазия акросомы Деградация акросомы Гипоплазия акросомы может быть причиной идиопатического бесплодия. Гипоплазия выявлена у 14% пациентов с идиопатиеским нарушением фертильности, деградация акросомы – у 16%.

19 Гиперплазия мембран ядерной оболочки сперматозоидов. Выявлена у 18% пациентов с идиопатическим бесплодием Многослойные мембраны ядерной оболочки

20 Нарушение строения митохондрий Митохондрии с электронно-прозрачным матриксом выявлены у 18% пациентов с идиопатическим нарушением фертильности. Нарушение строения митохондриальной спирали выявлено у 7% пациентов.

21 Результаты количественного ультраструктурного исследования половых клеток пациента Н. до и после лечения Содержание головок типичного строения Состояние хроматина ядер головок сперматозоидов Морфология акросомы Морфология митохондрий До лечения 20%47% - конденсированны й хроматин 43% - гранулярный «незрелый» хроматин 10% - деградация хроматина 40% - акросома типичной морфологии 24% - деградация акросомы 36% - гипоплазия акросомы 40% - митохондрии типичной морфологии 60% - митохондрии с электронно- прозрачным матриксом и вакуолизированным и кристами После лечения 50%70% - конденсированны й хроматин 23% - гранулярный «незрелый» хроматин 7% - деградация хроматина 66% - акросома типичной морфологии 8% - деградация акросомы 22% - гипоплазия акросомы 4% - Т-образная акросома 100% - митохондрии типичной морфологии

22 Вирусное инфицирование сперматозоидов Продольный срез через средний отдел жгутика сперматозоида (слева) и фрагмент поперечного среза (справа). В цитоплазматической капле обнаруживаются нуклеокапсиды вируса простого герпеса (ВПГ). Природа вируса подтверждена положительным результатом реакции иммунофлюоресценции с антителами к ВПГ. Аксонема жгутика Нуклеокапсиды вируса простого герпеса

23 Сперматозоиды, инфицированные вирусом простого герпеса Реакция иммунофлюоресценции (моноклональные антитела к белкам вируса простого герпеса)

24 1. Из эякулята пациентов без симптомов генитального герпеса могут быть выделены инфекционные вирионы вируса простого герпеса (ВПГ). 2. В ряде случаев при отсутствии в эякуляте инфекционных вирионов ВПГ в ядрах головок сперматозоидов определяется вирусная ДНК, а в цитоплазматической капле – вирусные белки (сперматозоиды являются носителями ВПГ). 3. Подвижные сперматозоиды типичной морфологии могут быть инфицированы (быть носителями) ВПГ. ВОПРОС: могут ли инфицированные сперматозоиды участвовать в оплодотворении и какова в этом случае судьба эмбриона? (Брагина и соавт., 2000; 2001; 2003)

25 Микробное загрязнение эякулята В эякуляте 9% пациентов выявлены микроорганизмы, в большинстве случаев покрытые плотной микрокапсулой Клетки плоского эпителия Грамнегативный кокк, окруженный микрокапсулой Микроколония покрытых микрокапсулой бактерий

26 Микрофлора эякулята Колония дрожжеподобных грибов Микроколония дрожжеподобных грибов расположена внутри полимембранных структур Мембраны, окружающие колонию грибов

27 Области применения метода количественного электронно-микроскопического анализа половых клеток при нарушениях фертильности мужчин 1. Дифференциальная диагностика генетически детерминированных («синдромных») и неспецифических форм патоспермии. 2. Выявление форм неспецифической патоспермии при идиопатическом нарушении фертильности мужчин. 3. Прогнозирование результатов ВРТ (определение индекса интактных сперматозоидов с типичной ультраструктурной организацией. Специфичность метода – 75% (Berkovitz et al., 1999; Baccetti et al., 2002).

28 Благодарим за внимание! Наш адрес в интернете: Телефоны: Прием пациентов: КЛЦ «Пастер» МГНЦ РАМН