Кратасюк Валентина Александровна профессор, д.б.н. (биофизика), зав.кафедрой биофизики, Институт фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, в.н.с. Института. - презентация

1 Кратасюк Валентина Александровна профессор, д.б.н. (биофизика), зав.кафедрой биофизики, Институт фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ, в.н.с. Института биофизики СО РАН, Courtesy Professor of University of Florida выпускник Программы Фулбрайта Научный проект (дипломная работа, магистерская диссертация)

2 Задание Составить краткий проект по теме дипломной работы (магистерской диссертации) по схеме: Проблема – решенные задачи –нерешенные задачи –цель проекта – гипотеза – план решения – открытие.

3 Кратасюк Валентина Александровна Д.б.н., проф., зав.кафедрой биофизики СФУ, Courtasy Professor of University of Florida 235 публикаций (12 авт.св., 2 патента, 52 статьи) Более 50 грантов (ИНТАС, РФФИ, РГНФ, Научная программа НАТО, Программа Фулбрайт, CRDF, программы Минобразования и др.) Приглашенный профессор: НАСА, Университет Флориды, Университет Северной Дакоты, ДВГУ и др. Конференции, выставки

4 Сферы профессиональной деятельности: государственные органы экологического и других типов контроля Госсанэпиднадзора, экологические службы различных предприятий, лаборатории контроля качества окружающей среды и диагностические лаборатории, Горно-химический комбинат г. Железногорска и др. Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Направление: физика Магистерская программа: «Биофизика» Руководитель программ: профессор, доктор биологических наук Валентина Александровна Кратасюк Основная цель программы «Биофизика» - подготовка специалистов в области биофизики, владеющих современной методологией научного поиска и навыками работы на современном оборудовании для биологии, биотехнологии, медицины и других отраслей. Направление: физика Магистерская программа: «Окружающая среда и человек: основы контроля и надзора» Цель программы - профессиональная подготовка и переподготовка специалистов экологических служб по контролю и оценке состояния природных ресурсов. Кафедра биофизики, Институт фундаментальной биологии и биотехнологии, СФУ, тел , ауд , В магистратуру принимаются лица, имеющие диплом государственного образца о высшем профессиональном образовании (диплом бакалавра или специалиста) любой специальности на конкурсной основе по результатам сдачи комплексного экзамена. Научная база - лаборатории кафедры физико-химической биологии, ЦКПП СФУ и НОЦ «Енисей», НИИ СО РАН., ФГУ «Центр госсанэпиднадзора в Красноярском крае» (ЦГСЭН), «Международный научный центр исследований экстремальных состояний организма» при Президиуме КНЦ СО РАН и др. курсы лекций известных профессоров ведущих российских и зарубежных ВУЗов. Визит-профессор Гительзон Г.И (Институт Белка РАН, г. Пущино) Визит-профессор Джон Ли (Университет Джорджии США)

5 Федеральное агентство по образованию Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» Положение о магистерской диссертации УТВЕРЖДАЮ Ректор СФУ ________ Е. А. Ваганов «___» ________ 2008 г. Принято на заседании Ученого совета СФУ « 02 » июня 2008 г. протокол 5 Красноярск 2008

6 Общие положения – Требования к содержанию, объему и структуре магистерской диссертации и ее защите. – Магистерская диссертация - выпускная квалификационная работа, являющаяся самостоятельным научным исследованием или проектом, выполняемым под руководством научного руководителя с возможностью привлечения одного или двух научных консультантов.

7 Общие положения – Доказательства компетенций автора в избранной области профессиональной деятельности: научно- исследовательской, научно- педагогической, опытно- и проектно- конструкторской, организаторской и пр.

8 Содержание диссертации результаты теоретических и экспериментальных исследований решение актуальных задач в области – науки, – техники, – технологии, – экономики, – менеджмента, – юриспруденции, – педагогики, – социального развития.

9 НАУЧНЫЙ МЕТОД

10 Фд - факты действительности, на которые направлено познание человека Фн - факты науки (отражение фактов действительности в науке) П - постановка проблемы(знание о незнании, осознанное незнание) Цель –формулировка вопроса Г - выдвижение гипотезы(научное предположение о существовании некоторого неизвестного явления, о его причинах, структуре, функциях), возможный ответ на вопрос Д - научное доказательство (процесс обоснования гипотезы) Т - новое теоретическое знание

11 НАУЧНЫЙ МЕТОД Проект в научный фонд Научная статья Доклад на научной конференции Курсовая работа Дипломная работа Магистерская диссертация Кандидатская диссертация Докторская диссертация Коммерческий проект (по форме)

12 Цели магистерской диссертации Показать: уровень профессиональной и общеобразовательной подготовки выпускника по соответствующей магистерской программе; умение изучать и обобщать литературные источники в соответствующей области знаний; способность самостоятельно проводить научные исследования, выполнять проектные работы, систематизировать и обобщать фактический материал; умение самостоятельно обосновывать выводы и практические рекомендации по результатам проведенных исследований.

13 Требования к магистерской диссертации Объем без приложений составляет: 70–80 страниц печатного текста для технических направлений 80–100 для гуманитарных направлений. Диссертация должна быть: актуальной и решать поставленную задачу; содержать элементы научного исследования; выполняться с использованием современных методов получение результатов, имеющих научную новизну и теоретическое, прикладное или научно-методическое значение; апробацию результатов на научных конференциях и в публикациях в научных журналах и сборниках. Магистерская диссертация не должна иметь исключительно учебный или компилятивный характер.

14 Требования к структуре работ ы 1.Титульный лист (Cover Page) 2.З 2.Задание на диссертацию 3. Р 3. Реферат (на английском языке) 4.Основное содержание проекта (Project Description): – Введение – Литературный обзор – Материалы и методы – Результаты – Обсуждение результатов – Выводы 5.Заключение Литература (References) 6. Литература (References) 7.Приложения; 8.Вспомогательные указатели.

15 Написание проекта (план) Что такое проект (proposal)? Что такое проект (proposal)? Для чего их пишут? Для чего их пишут? – Проект - формальный документ, описывающий серию экспериментов, которые предполагаются провести для получения новой информации по специфической теме или из специальной области. – Постановка задачи и план для магистерской диссертации

16 Каким образом проект (работа) будет оцениваться? – Соответств ие научной методологии – Вероятность осуществления целей проекта – Соответствие специальности – Соответствие требованиям к (магистерской) работе.

17 Название проекта (работы), понятное научно образованному читателю –"Роль духовых инструментов в духовном становлении духовенства –Эффективность транспортировки химического соединения Н20 в таре, характеризующейся крупной пористостью –"Дуалистический принцип использования сельскохозяйственных орудий на гидроповерхности" (Вилами по воде писано) – "Бинарный характер высказываний индивидуума утратившего социальную активность" (Бабушка надвое сказала) –"Оптимизация динамики работы тяглового средства передвижения, связанная с устранением изначально деструктивной транспортной единицы" (Баба с возу - кобыле легче)

18 Другие «научные» названия "Нестандартные методы лечения сколиоза путем отправления ритуальных услуг" (горбатого могила исправит) "Проблемы повышения мелкодисперсионности оксида двухатомного водорода механическим путем" (толочь воду в ступе) "Положительное воздействие низкого коэффициента интеллекта на увеличение совокупности задач в процессе осуществления трудовой деятельности (работа дураков любит) "Солипсизм домашней птицы по отношению к нежвачным млекопитающим отряда парнокопытных" (гусь свинье не товарищ) "Характерные внешние приметы как повод для узурпации наиболее благоприятного социального статуса на рынке" (со свиным рылом да в калашный ряд)

19 Другие «научные» названия "Антропоморфический подход к созданию брачной ячейки" (кому и кобыла невеста) "Синдром отказа от легитимизации, опирающийся на отсутствие возможностей быстрой идентификации личности" (я не я, и лошадь не моя) "Влияние сезонно-погодных условий на процесс бухгалтерского учета пернатых" (цыплят по осени считают) "Амбивалентная природа нейронных импульсов, испускаемых корой головного мозга" (и хочется, и колется) "Закономерности соотношения длины ороговевшего эпидермиса с количеством серого вещества в черепной коробке" (волос долог, да ум короток)

20 Другие «научные» названия "Разновидность юридического акта, превалирующего над валютными средствами" (уговор дороже денег) "Недопустимость использования типовых элементов жилищной архитектуры при отрицании кульминационного проявления созерцательно-осязательных эмоций" (любовь не картошка, не выбросишь в окошко) "Нейтральность вкусовых характеристик растения семейства крестоцветных по отношению к овощным культурам средней полосы России" (хрен редьки не слаще) "Антитезисные свойства умственно-неполноценных субъектов в контексте выполнения государственных нормативных актов" (дуракам закон не писан) "Отсутствие прогресса-регресса в метаболизме организма при изменении соотношения жиров и углеводов в традиционном блюде оседлых народов" (кашу маслом не испортишь)

21 Титульный лист (The Cover Page) Титульный лист содержит следующую информацию: Титульный лист содержит следующую информацию: – Краткое название проекта (работы), понятное научно образованному читателю – Название должно подходить для публикации – 9 слов в названии – Ключевые слова найти – Контактная информация об авторах и руководителях (имя, номера телефонов, факсов, e- mail) – Дата представления проекта – Подписи

22 ТЕЗИСЫ (The Abstract) Включает краткие (мах. 150 слов) тезисы, описывающие цели и методические подходы, но без детализации Включает краткие (мах. 150 слов) тезисы, описывающие цели и методические подходы, но без детализации Основные ударные положения проекта должны быть включены в тезисы Основные ударные положения проекта должны быть включены в тезисы Специфические детали и обсуждение не должны быть включены в тезисы Специфические детали и обсуждение не должны быть включены в тезисы Придумывать в начале. Писать последним

23 Реферат должен содержать: сведения об объеме диссертации (количество страниц); количество иллюстраций (рисунков), таблиц, приложений, использованных источников; перечень ключевых слов – Перечень ключевых слов характеризует основное содержание магистерской диссертации и включает до 10–15 слов в именительном падеже, написанных через запятую в строку прописными буквами. краткую характеристику работы. Объем краткой характеристики работы 1500–2000 печатных знаков (примерно одна страница). Краткая характеристика работы должна отражать тему, предмет, характер и цель диссертации, методы исследования, полученные результаты и их новизну, область применения, возможность практической реализации.

24 Введение Должно быть включено обсуждение настоящего состояния науки в изучаемой области, основанного на предыдущих исследованиях или исследованиях, проводимых в настоящий момент Должно быть включено обсуждение настоящего состояния науки в изучаемой области, основанного на предыдущих исследованиях или исследованиях, проводимых в настоящий момент Доказательства необходимости проекта – изложение данных литературы (с особым вниманием к тому, что осталось невыясненным), – постановка задачи, – и (иногда) описание главного методического подхода к проблеме

25 Введение: что известно Краткий обзор литературы начинается с описания ситуации в более широкой области науки, а потом тема, наподобие воронки, сужается всё больше и больше, направляя внимание непосредственно к предмету исследования.

26 Что неизвестно и почему? Для постановки задачи важно не то, что известно науке, а то, что науке неизвестно. Чтение научной литературы для учёного: – Разбираться в проблеме – Понять пробелы в знаниях человеческого общества, которые нужно ликвидировать

27 Что неизвестно и почему? Как отличить то, что неизвестно лично мне, от того, что неизвестно никому? Ни чтение литературы, ни посещение научных конференций не даёт полной гарантии от непроизвольного повторения в своих исследованиях того, что уже известно, т. е. от бесполезной работы. Понимание того, почему другие не смогли или не успели получить те данные, которые планируем получить мы, заметно уменьшает риск повторения пройденного.

28 Описание проекта: научные цели Формулирование вопросов Гипотеза – предполагаемый ответ Формулировка научной цели Цель работы принято формулировать прямолинейно: – Задачей настоящей работы было выяснить, какое влияние … и т.д. – …. Понять почему? – ….понять механизм? Закономерности и т.д. Можно, конечно, придумать что-нибудь поновее, но в том же духе.

29 При формулировке гипотезы Гипотеза – возможные ответы; Гипотеза – возможные ответы; обсуждение природы и количества данных, которые нужно получить; обсуждение природы и количества данных, которые нужно получить; описание методов или подходов, которые будут использованы описание методов или подходов, которые будут использованы описание и обсуждение достоинств предполагаемого подхода перед всеми альтернативами; описание и обсуждение достоинств предполагаемого подхода перед всеми альтернативами; значение ожидаемых результатов значение ожидаемых результатов

30 Как делали В разделе (статьи, дипломной работы или диссертации) «Материалы и методы» обычно подробно описываются методы, используемые в работе.. Неписанный закон гласит: Любой компетентный ученый должен иметь возможность повторить все Ваши опыты, прочитав Вашу статью

31 МЕТОДЫ – Общая схема экспериментов – Подробное описание методов и процедур – Перечислить основное оборудование – Описать достоинства этого подхода

32 Календарный план (Time Table) Этап 1: Исследования, проект и подготовка лаборатории к экспериментам Этап 2: подготовка приборов, предварительные эксперименты, калибровочные кривые, установка контрольных экспериментов для сравнения. Этап 3: Сбор образцов, экстракция НАДН, начало экспериментов с биолюминесценцией. Этап 4: Продолжение экспериментов, сравнительный анализ полученных результатов. Этап 5: Анализ полученных результатов/статистическая обработка Этап 6: Отчет и подготовка постера

33 Ожидаемые результаты Калибровочная кривая Предполагаемый ответ -цель + + (hypothetical data)

34 Обсуждение результатов «Обсуждение результатов» - это зеркальное отображение «Введения». «Введение»: обоснование задачи конкретного исследования, исходя из уровня современной науки. «Обсуждении результатов»: понять значение ожидаемых результатов для науки в целом

35 Обсуждение результатов и заключение Осмысливание предполагает сравнение полученных данных не только между собой, но и с имеющими отношение к делу данными других авторов. Конечная цель обсуждения - понять, что же изменится в мировой науке в результате данной работы. Новизна.

36 Непосредственная же задача обсуждения обосновать общее заключение, главный вывод (или выводы) из работы ответ на поставленный вопрос- гипотезу формулировка новой гипотезы. описание перспектив работы

37 Подводные камни и ограничивающие обстоятельства Причины, которые могут помешать выполнению проекта Отсутствие нужных приборов и реактивов Трудность получения контрольных образцов Другой ответ на гипотетический вопрос: или…или Относительность измерений – невозможность измерить точные концентрации

38 Ссылки (References) Цитированный источник Цитированный источник Статья в журнале, тексты, личные сообщения, Интернет-источники и т.д. Статья в журнале, тексты, личные сообщения, Интернет-источники и т.д.

39 Bioluminescence in the Spaceflight and Life Science Training Program (SLSTP) at Kennedy Space Center

40 Spaceflight and Life Sciences Training Program Provides Space Science research for the best & brightest college students Six week summer program managed by NASA s ESMD, Dynamac Corp. and Bionetics Corp.(SLSL – O&C – BOSU)

41 Цель: создание биолюминесцентных биосенсоров для проведения экспериментов в климатических камерах и теплиц на Марсе (to design bioluminescent biosensors for a simulated flight experiment in environmental chambers and Mars greenhouse at KSC) Для контроля стресса у растений (for in-situ monitoring the stress responses in plants growing in Mars greenhouse and environmental chambers). Для контроля за загрязнением воздуха, воды и почвы в замкнутых экологических системах (for control air, water and soil contaminations in closed ecological systems ) Plant stem

42

43 Биолюминесцентные биосенсоры для космических технологий Bioluminescent Biosensors for Space Biotechnology Glowing Experiments Team Russian PIs: Prof. Valentina Kratasyuk, Dr. Sergey Gusev USA PIs: Prof.. Ray A. Bucklin, Dr. Melanie Correll, Dr. Vadim Rygalov, SLSTP: Dr. Tom W.. Dreschel, Dr. Peter V. Chetirkin Diane Shoeman, SIFT teacher, Merritt Island HS SLSTP Trainees : Frank Mycroft, Li Yang

44 Bioluminescent Biosensors: Monitoring Plant Health in Space, on the Moon and Mars Frank Mycroft SLSTP Trainee Environmental Systems Group Under Principle Investigator Dr. Valentina Kratasyuk Krasnoyarsk State University

45 Brief Overview Project purpose Important terminology and reactions Why biosensors over mechanical and chemical sensors Plant stresses/health Hypothesis, methods, outcomes, limitations

46 June 23, Introduction: Our Purpose Keep plants healthy in space and on future greenhouses on and off our world Improve our understanding of plant requirements here on Earth Develop portable biological probes to to supplant larger mechanical ones

47 Introduction We will monitor the stress responses (the levels of NADH and ATP) in plants being grown in the Mars greenhouse, using the enzymatic reactions of bioluminescent organisms

48 Why Biosensors? Near instantaneous response times High sensitivity Quantitative results User-friendly Allow for rapid biotests

49 Why Biosensors? The heart of mechanical monitoring systems are often large and cumbersome: Gas Chromatograph

50 Why Biosensors? Biosensor The main component of biosensors is rather small:

51 Why Biosensors? Bioluminescent Escherichia coli (genetically modified strain) __ Zooming in…

52 Lastly, they are fun to work with

53 Various applied stresses Control (Stress-free) Low Pressure High CO 2 Desiccation Hypoxia – flooding plants to root/shoot junction

54 SPECIFIC ASSAYS in Coupled Enzyme System: oxidoreductase-luciferase - NADH (NADPH), FMN, NAD(NADP) +, aldehyde, O 2 FMN NAD(P)* NAD(P)H Oxidoreductase FMNH 2 Luciferase RCHO RCOOH O2O2 H2OH2O H+H+ NADH:FMN-oxidoreductase NADH (NADPH) + H+ + FMN NAD(NADP) + + FMNH 2 (1) luciferase FMNH 2 + RCHO + O 2 FMN + RCOOH + H 2 О + h (2)

55 Hypothesis Applying different stresses to plants will reduce their NADH production, thereby reducing the primary reagent for the bioluminescent reaction, measurably dimming biosensors. NADHPlant StressNADH thus Plant Stress

56 Materials Bioluminometer NanoCeram ® Filters from Argonide Co. 3000g Centrifuge Balance (accurate to g) Flasks, mortar and pestle, test tubes, micropipettes, syringes Vortex genie Plant samples from SLS lab Mars greenhouse and environmental chambers before and after applied stress Chemicals including: – Luciferase – Oxidoreductase – Myristic aldehyde – NADH, FMN, EtOH, NAD(P)H:FMN:OR – Potassium phosphate buffer Recombinant E. coli (+LUX-gene)

57 Experimental Method Obtain samples of plants Test for correlation between chemical- grade NADH concentrations and luminescence Extract NADH from plant samples Bioluminescent assay of NADH in plant extracts w/ luminometer Extract w/ waterExtract w/ ethanol Data analysis and comparison of stresses between plants Before stress After stress

58 Ожидаемые результаты

59 A Needle-type Nanomaterial-integrated Luminescent Sensors for In-situ Plant Physiology Monitoring ? BL Biolumino- meter

60 Pitfalls and Limitations Changes in luminosity may arise from variations in sample size, extract purity, and the thoroughness of the mixing procedure. Relative measurements only – no way to measure absolute concentrations of NADH Want to limit damage to plants Difficult to determine the source of stress

61 Time Table Week 1: Research, proposal and lab preparation Week 2: Calibrate bioluminometer, NADH calibrative curve, set controls for comparison. Week 3: Sample acquisition, NADH extraction, begin bioluminescent experiments. Week 4: Continue bioluminescent experiments, compare results between Mars greenhouse and more standard SLSL environmental chambers. Week 5: Data Analysis/Statistical Significance Week 6: Final Report and Poster Preparation

62 References Cantarow, Walter and B. David Stollar. (1976) Analytical Biochemistry. 71, Karp, Matti T., Raimo P. Raunio and Timo N-E. Lovgren. (1983) Analytical Biochemistry. 128, Kratasyuk, Valentina, Sergey Gusev, Ray Allen Bucklin and Melanie Correll. (2005) Glow to Grow Experiment. SLSTP 2005 Roda, Aldo, Massimo Guardigli, Elisa Michelini, Mara Mirasoli, Patrizia Pasini. (2003) Analytical Chemistry Schmid, Ulrike, Karl-Ludwig Schimz and Hermann Sahm. (1989) Analytical Biochemistry. 180,

63 Acknowledgements Dr. Valentina Kratasyuk, Professor and Director of the Biophysical Dept. of Krasnoyarsk State University Ms. Diane Shoeman, Science Teacher at Merritt Island High School Julie Yang, Fellow Environmental Systems SLSTP Trainee working with bioluminescence Dr. Michael Roberts, Principle scientist LSSC Molecular Microbial Ecology Laboratory Ms. Brittanian Medina, Environ. Systems PC Project Counselors, Principle Investigators, and all those working to make NASA and SLSTP what it is today Thank You!

64 Questions? "Think Big, Talk Little, Love Much, Laugh Easily, Work Hard, Give Freely, Pay Cash, And be Kind. --It is enough." - Ralph Waldo Emerson

65 Bioluminescent Assay of Pyridine Nucleotides for Monitoring Plant Stress Abstract A bioluminescent assay for monitoring key metabolites that are indicators of stress in plants has been developed to study the effects of cold storage on the reduced and oxidized levels of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD(P)H and NAD(P) + ). Enzymes of luminous bacteria – luciferase and NAD(P)H:FMN-oxidoreductase – were used to develop bioluminescent assays to measure such metabolites as NAD(P)H, NAD(P) + in plant extracts. A procedure for the extraction of reduced and oxidized forms of nicotinamide adenine dinucleotide from plant tissue was developed. The amount of NAD(P)H and NAD(P) + in plant extracts dependened on the duration of plant storage at 4˚C. Longer storage time resulted in increasing of NAD(P) + /NAD(P)H ratio suggesting increased oxidative stress of tissues. The developed assays are rapid, low cost and easily performed to quantify key metabolites in plant tissues and can be used to indicate the quality of food. Introduction Bioluminescence may be used as a feedback mechanism to control environmental systems through the detection of the different levels of metabolic compounds and enzyme activities in vivo and in situ. Pyridine and Flavine nucleotides are key redox carries in the soluble phase of all living cells and both play crucial roles in pro- and antioxidant metabolism and non-redox mechanisms in particular in plant stress responses. Several studies show that pyridine and flavine nucleotides pools are plastic in plants, and can undergo significant changes in response to the environment. In addition, stress can alter the NAD(P)+/NAD(P)H ratio. Through the use of the enzymatic systems of luminous bacteria it is possible to compare the levels of key metabolites (NAD(P)H, NAD(P)+, FMN, aldehyde) in plant extracts from healthy and stressed tissues. The extraction and measurement of reduced and oxidized forms of nicotinamide adenine dinucleotide can be performed using a single-step procedure with light-producing bacterial luciferase reaction that is coupled with alcohol dehydrogenase (ADH) reaction in following scheme (Figure 1): ADH NAD + + Et(OH) NADH + acetaldehyde NADH:FMN - oxidoreductase NADH + H + + FMN FMNH 2 + NAD + Luciferase FMNH 2 + RCHO + O 2 FMN + RCOOH + H 2 O + light A bacterial bioluminescent reaction with luciferase and NADH - specific oxidoreductase emit light directly proportional to the amount of NADH in the sample when NADH concentration is limited. After NADH has been measured, NAD + present in extract was enzymatically converted to NADH by ADH and luminescence measured. Here, we describe a simple procedure for the measurement of NADH and NAD + by bioluminescent assays to monitor oxidative stress in plants. References 1.Brolin SE, Naeser P. (1992) Biochem Biophys Methods. Oct; 25 (2-3), Golden S and Katz J. (1980) Biochemistry J., 188, Karp, Matti T., Raimo P. Raunio and Timo N-E. Lovgren. (1983) Analytical Biochemistry. 128, Karp MT, Vuorinen PI. (1986) Methods Enzymology. 122, Kratasyuk V.A. and Esimbekova E.N. (2003) Polymeric Biomaterials. Ed. R. Arshady. London: Citus Books, Kratasyuk, Valentina, Sergey Gusev, Ray Allen Bucklin and Melanie Correll. (2005) Glow to Grow Experiment. SLSTP Kudryasheva N.S., Kudinova I.Y., Esimbekova E.N. et al. (1999) Chemosphere. 38 (4), Kudryasheva N.S., Esimbekova E.N., Kudinova I.Yu. et al. (2000) Applied Biochemistry and Microbiology, 36 (4), Robertson D., Davies D., Gerrish Ch et al. (1995) Plant Molecular Biology. 27, N.Remmel 1, E.Esimbekova 1, M.Correll 2, R.Bucklin 2 and V.Kratasyuk 1 1 Krasnoyarsk State University, Russia 2 University of Florida, USA Materials and Methods Radish (Raphanus sativus L. cv Cherry Bell) plants or corneplodes were purchased from the local grocery store and used for assays. The storage roots were subjected to stress treatments (stored in a refrigerator 4°C for several days) and evaluated for NAD(P)H and NAD(P) + concentration in ethanol extracts by bioluminescent methods. All steps of extraction procedure were performed at 4˚C and were adapted from (Golden and Katz, 1980). A sample of 1 g of fresh or frozen (liquid nitrogen) radish roots tissue was ground and homogenized in 5 ml of 70% (v/v) ethanol solution with mortar and pestle, kept for 20 min before being squeezed through 5 layers of cheese cloth. Extracts were centrifuged at 3000 x g for 20 min and the supernatant was used for NADH and NAD + assays. All assays were performed at room temperature. The background of bioluminescent signal (I background ) for NADH assay was measured in reaction mixture consisted of the following reagents: 150 µl of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.8), 90 µl of NADH monitoring reagent (luciferase and NADH:FMN-oxidoreductase), 10 µl of 0.05 mM FMN and 10 µl of 0.002% ( v/v ) myristinaldehyde and 5 µl of 70 % (v/v) ethanol. To measure concentration of NADH in tissue extract 5 µl of plant extract were added to the reaction mixture instead of ethanol and the maximum bioluminescent signal I in the sample was recorded (Table 1). Real bioluminescence was calculated as I sample - I background. The NAD+ present in the sample was then converted to NADH with ADH reaction (Table 2). Concentrations of NADH and NAD + were calculated according standard calibration curves as differences between total nucleotides content or the systems could be internally calibrated by adding known amounts of nucleotides. Duplicate samples agreed within 5%. Lyophilized NADH monitoring reagent includes enzymes Luciferase (L) from Photobacterium leiognathi (0.5 mg), as well as NADH:FMN-oxidoreductase (R) from Vibrio fischeri (0.15 units of activity) were provided by the Bacterial Bioluminescence Laboratory of the Institute of Biophysics, SB RAS (Krasnoyarsk, Russia). Fluorimeter FL*800 (Bio-tek instruments, Inc) was used to measure bioluminescence signals. The nucleotide concentration was calculated as moles per milligram of protein. Spectrophotometer (DU 800 Beckman Coulter) measurements were performed to compare different measurement techniques. Results and Discussion The procedures for monitoring NADH and NAD + by coupling the alcohol dehydrogenase (ADH) reaction to the light-producing bacterial luciferase reactions has been developed for radish roots. Ethanol was used to extract NAD(P)H and NAD(P) + from plant tissue so that the assay system included all necessary substrates and enzymes to produce light except ADH. This method was used to monitor of pyridine nucleotides from radish exposed to stress conditions i.e., cold storage at 4°C. The bioluminescent assay detected pyridine nucleotides at the nanomolar level, one hundred times lower than the detectable limit for NADH by spectroscopic methods (Figures 2 and 3). This enhanced sensitivity of the assay can measure NADH in milligram amounts of plant tissue. For example, for the storage roots of radish as little as100 mg of tissue was enough to quantify NADH using only 5 µl from the extracted sample. These results demonstrate that pools of pyridine nucleotides are altered during storage of plants even at low temperature. A 5.5 – fold decrease in NADH content and a 1.6 – fold increase for NAD + from roots radish under stress treatment (storage after 7 days) was found when compared with the controls. Thus, the ratio of NAD + / NADH increased 4 - fold after 7days of storage. Our results agree with previous studies that show alteration in pyridine nucleotides levels in response to the environment (Robertson et al., 1995). The fact that the NAD(P) +/ NAD(P)H pair takes part in a very large number of metabolic redox reactions makes it a universal indicator of the redox state and bioenergetic status of tissue. There has been a continual interest in, and need for, reliable detection methods for the measurement of redox state in plant tissue. Bioluminescent methods have several advantages over traditional methods for detection of chemicals because they are rapid, have reagent stability, have robust performance in harsh conditions, and are easily performed. Applications of this system may aid in improving diagnostics for food quality and the development of better storage techniques for produce. Future Work Tests are underway to compare different levels of metabolites using the bioluminescent assay developed here to monitor the oxidative state of plants during growth and storage. Stress treatments will include increases in temperature and alterations in the gas phase surrounding tissues (CO 2, low pressure etc.). Conclusions The extraction and measurement of reduced and oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide can be performed using a single- step procedure with the light-producing bacterial luciferase reaction coupled with alcohol dehydrogenase. This method can readily be adapted to measure metabolite concentration as possible indicators of stress of produce during cold storage. Objectives To study the concentrations of key metabolites in stress- treated plants. Measure the contents of pyridine nucleotides in plants by bioluminescent method Evaluate metabolite concentration and NADH/NAD + ratio with stress Table 1. Assay of NADH 10 µL 0.002% RCOH in EtOH 10 µL 0.04mM FMN in Buffer 90 µL Luciferase 150 µL Phosphate Buffer 5 µL Sample Institute of Food and Agricultural Sciences Agricultural & Biological Engineering Department Table 2. Assay of NAD + 10 µL 0.002% RCOH in EtOH 10 µL 0.04mM FMN in H 2 O 90 µL Luciferase 150µL Phosphate Buffer 5 µL Sample 5 µL ADH Figure 1. Bioluminescent assay in a triple enzymatic reaction with alcohol dehydrogenase - FMN ADH R NAD + HADH FMNH 2 Light Et(OH) Acetaldehyde NAD + RCOH RCOOH L Figure 2. Standard curve for NADH, expressed as a logarithmic function of light intensity obtained as relative units (RU). Acknowledgements This research has been supported by Fulbright Program (fellowship for Prof. Valentina Kratasyuk), Programs of Russian Federal Agency on Science and Innovations Fellowships for young scientists and teachers on research in Foreign Scientific Centers, contracts N , N and IFAS at the University of Florida. The authors gratefully acknowledge the skillful technical assistance of Veronica Campbell for use of equipment and Frank Mycroft with poster. We also thank Sergey Sirotinin for constructive comments and discussions. Figure 3. Standard curve for NADH absorption at 340 nm, expressed as a logarithmic function obtained as relative units (RU). 7 7

66 Go Discovery!

67 Проект «Сравнительный анализ роли науки в образовании в университетах США и России» Предпосылки Модели образования и науки в США и России существенно различаются: – в США - наука и образование в университетах – в России - образование - в университетах, наука - в РАН, университетах, научных организациях военно-промышленного комплекса и отраслевых министерств. Интеграция науки и высшего образования России: – НОЦ «Исследовательская кафедра биофизики» (ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России») – НОЦ «Енисей» (проект "Фундаментальные основы экологизации образования и технологий", Российско-Американская Программы "Фундаментальные исследования и высшее образование"). Реформа образования в России -ПОИСК МОДЕЛИ

68 Портативная система мониторинга химико-биологической опасности для человека Руководитель проекта д.б.н., профессор Кратасюк В.А. Институт фундаментальной биологии и биотехнологии СФУ

69 Проблема Острая необходимость в высокочувствительных методах обнаружения токсичности – В окружающей среде: быстрое обнаружение токсичных и опасных веществ – В здравоохранении: мониторинг содержания терапевтических препаратов в организме человека – В пищевой промышленности: анализ качества продуктов питания для предотвращения отравлений Известные методы анализа не решают проблемы – Химический анализ не позволяет определять влияние токсинов на биологические объекты – Биотесты на живых организмах дороги в использовании, дают большую ошибку и низкую повторяемость – Существующие биотесты в основном используются для мониторинга окружающей среды и требуют специальной подготовки персонала

70 FMN + NADH + H + FMNH 2 + NAD + FMNH 2 + R 1 COH + O 2 FMN + R 1 COOH + H 2 O + R Membrane Inhibitors Ag chlorine Cytoplasmic membrane Aldehydes, Cationic agents, Heavy metals Heavy metals, Phenols Polar agents, solvents, alcohols Wall Heavy metals (cadmium), Phenolics (Dichlorophenol) Protonmotive force Electron transport system Non-polar organics (Toluene) Oxidative phosphorylation uncouplers (phentachlorophenol, SDS) Respiratory blockers eg cyanide Membrane ATPase Cytoplasmic constituents L h 490 nm Светящиеся бактерии

71 Luminous Bacteria and Coupled Enzyme System: R+L Assay: Scheme of Analysis luminescence I с Luminous bacteria, Enzymes control test luminescence I е sample Bioluminometer to attract attention to an extraordinary situation and to do this quickly and in the simplest and cheapest way

72 Идентификация токсина BEST TM Биолюминесцентная ферментативная технология Уникальная коллекция светящихся бактерий – источник ферментов Обширный банк методов и многопрофильных биотестов Эксклюзивный производственный процесс Быстрая система обнаружения Скрининг на токсичность

73 BEST TM Designer Bioassays Иммобилизация компонентов системы Выбор биосистемы, чувствительной к токсину Результат за 60 секунд Не требуется подготовки образцов Не требуется спецподготовки персонала Оптимизация субстрата и фермента специфичност ь универсальнос ть чувствительнос ть стабильность устойчивость обнаружение в один этап Преимущества

74 Возможности технологии Новая технология позволяет – Тестировать широкий спектр токсинов – более веществ – Проводить экспресс скрининг в чрезвычайных ситуациях – Проводить биотестирование воды с высоким содержанием органики – Сохранять высокую чувствительность реагентов в течении многих лет – Использовать стандартное измерительное оборудование – Сконструировать биосенсор Цена одного теста Врем я теста Чувствитель -ность Условия хранения, перевозки и использован ия Пробо- подготовка Повторяемост ь результатов Требования к персоналу Био тесты $380 - $3,240 до 7 дней Стандартна я Культура живых организмов ДаНизкаяСпецподго- товка BEST T M Много меньше Неме длен но Под заказ-30C до +50CНетОчень высокая Минимальна я подготовка Дешевле … Лучше … Быстрее

75 Биомодуль + измерительная часть (трансдьюсер) От биолюминометра к биосенсору Plant stem стебель

76 Биосенсоры для экологического мониторинга природных водных экосистем, промышленных стоков, качества воды и почвы S N

77 Положение Введение (содержит четкое и краткое обоснование выбора темы и выдвигаемой гипотезы, определение ее актуальности, предмета и объекта исследования, формулировку ее целей и задач, описание используемой при выполнении работы методов эмпирического исследования и обработки данных). Основная часть содержит критический анализ состояния проблемы, предлагаемые способы решения проблемы, проверка и подтверждение результатов исследования с указанием практического приложения результатов и перспектив, которые открывают итоги диссертационного исследования.

78 Положение Заключение – последовательное логически стройное изложение итогов и их соотношение с общей целью и конкретными задачами, поставленными и сформулированными во введении. Заключение может включать в себя и практические предложения, что повышает ценность теоретического материала. Список использованных источников. Каждый включенный в список использованной литературы источник должен иметь отражение в тексте диссертации.

79 Положение Приложения. Каждое приложение должно начинаться с нового листа с указанием вверху листа по центру слова «Приложение» и иметь тематический заголовок. Вспомогательные указатели. Магистерская диссертация, как правило, снабжается вспомогательными указателями (наиболее распространенные – алфавитно-предметные указатели, представляющие собой перечень основных понятий, встречающихся в тексте, с указанием страниц).

80 Требования к оформлению Текст диссертации набирается на компьютере, шрифт – Times New Roman 14-го размера, межстрочный интервал – 1,5. Номера страниц проставляют в центре нижней части листа, тем же шрифтом, что и текст диссертации. Расстояние от края бумаги до границ текста следует оставлять: в начале строк – 30 мм; в конце строк – 10 мм; от верхней или нижней строки текста до верхнего или нижнего края бумаги – 20 мм.

81 Требования к оформлению – Размер абзацного отступа должен быть одинаковым по всему тексту диссертации и равным 12,5 мм. Разделы должны иметь порядковые номера в пределах всей диссертации, обозначенные арабскими цифрами. Подразделы должны иметь нумерацию в пределах каждого раздела. Номера подразделов состоят из номера раздела и подраздела, разделенных точкой. В конце номера подраздела точка не ставится. Нумерация пунктов должна состоять из номера раздела, подраздела и пункта, разделенных точкой.

82 Требования к оформлению Заголовок разделов, подразделов и пунктов следует печатать с абзацного отступа с прописной буквы без точки в конце, не подчеркивая. Расстояние между заголовком и текстом должно быть равно 3 интервалам. Расстояние между заголовками раздела и подраздела – 2 интервала. Список использованных источников должен быть оформлен в соответствии с ГОСТ «Библиографическая запись. Библиографическое описание». Графическая часть диссертации (чертежи, схемы и т. п.) выполняется с соблюдением соответствующих государственных стандартов.

83 Положение Организация работы над диссертацией –Помимо закрепления темы магистерской диссертации за студентом процесс выполнения диссертации включает следующие этапы: а) составление задания и выбор направления исследования; б) теоретические и прикладные исследования; в) оценка результатов исследования и оформление диссертации; г) подготовку к защите; д) защиту диссертации. –Рекомендации по организации и проведению этапов выполнения магистерской диссертации, указанных в подпунктах а – в пункта 6.1. настоящего Положения разрабатываются соответствующими выпускающими кафедрами на основании настоящего Положения и утверждаются проректором по магистратуре.

84 Карикатура 1913 года: защита С. В. Лебедевым магистерской диссертации

85 Пиши грамотно Проверь правильность написания слов и пунктуацию Исключить сокращения по возможности Список используемых сокращений Замечания по стилистике

86 Благодарности Вежливость и справедливость требуют, чтобы Вы поблагодарили всех, кто Вам помогал в написании проекта

87 Questions?

88 Литература

89 Biology Writing Guidelines de/biogdline.html de/biogdline.html Guidelines on Style for Scientific Writing

90 Задание Составить краткий проект по теме дипломной работы (магистерской диссертации) по схеме: Проблема – решенные задачи –нерешенные задачи –цель проекта – гипотеза – план решения – открытие.