Российский национальный исследовательский медицинский университет Кафедра клинической лабораторной диагностики ФДПО Щербо Сергей Николаевич СОВРЕМЕННЫЕ. - презентация

1 Российский национальный исследовательский медицинский университет Кафедра клинической лабораторной диагностики ФДПО Щербо Сергей Николаевич СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И БИОМАРКЕРЫ ЛАБОРАТОРНОЙ И ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ.

2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАРКЕРА Согласно определению FDA биомаркер это характеристика, которая объективно измерена и оценена как индикатор нормальных биологических либо патогенных процессов или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство. Биомаркеры могут классифицироваться на количественные, качественные или комплексные. По клиническому применению прогностические, предиктивные и фармакодинамические.

3 Диагностические панели Различные биологические структуры могут служить био маркерами и их часто объединяют в панель, учитывая относительный вклад каждого из них, чтобы увеличить уверенность, что результаты действительно отображают всю клиническую картину. Диагностическая значимость анализа улучшится, если добавить большее число биомаркеров, обладающих высокой специфичностью к данной патологии. Такие биомаркеры могут быть по биологической природе самыми разнообразными: микроэлементы, метаболиты, генетические полиморфизмы, транскрипты, различные РНК, протеины.

4 Грядет эра персонализированной медицины и готовиться к ней нужно уже сегодня. Джордж Черч Медицина 4 «П» Медицина XXI века Предиктивная (предсказательная) Предупредительная (профилактическая) Партисипаторная (participatory) – пациент участник процесса, его информируют и обучают. Ему помогают в выборе, о нем заботятся. Персонализированная (индивидуальная) Лерой Гуд (Leroy Hood) США, 2008)

5 ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНА ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ИНТЕГРАЛЬНУЮ МЕДИЦИНУ, КОТОРАЯ ВКЛЮЧАЕТ РАЗРАБОТКУ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННЫХ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ГЕНОМИКИ, ПРОТЕОМИКИ И ДРУГИХ «ОМИК», ТЕСТИРОВАНИЯ НА ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К ЗАБОЛЕВАНИЯМ, ПРОФИЛАКТИКУ, ОБЪЕДИНЕНИЕ ДИАГНОСТИКИ С ЛЕЧЕНИЕМ И МОНИТОРИНГОМ ЛЕЧЕНИЯ

6 ЗАДАЧИ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ: 1. ПОНЯТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ЗАБОЛЕВАНИЯ И НАЙТИ НАИБОЛЕЕ ВАЖНЫЕ БИОМАРКЕРЫ 2. СОЗДАНИЕ ЛЕКАРСТВННЫХ СРЕДСТВ, НАИБОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНО ДЕЙСТВУЮЩИХ НА НУЖНЫЕ МИШЕНИ, СВЯЗАННЫЕ С ПАТОЛОГИЕЙ 3. БОЛЕЕ ГЛУБОКОЕ ПОНИМАНИЕ ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ ПОДПОПУЛЯЦИЙ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, РАЗДЕЛЕНИЯ ИХ НА ТИПЫ И ПОДТИПЫ

7 Ключевые результаты проекта GABRIEL ( г.г. ) Обнаружены новые гены, участвующие в иммунном ответе, проницаемости эпителия бронхов и контроле скорости восстановления повреждений слизистой оболочки дыхательных путей. Астму считали единой болезнью. Но полученные результаты предполагают биологические различия для трех клинических форм: детская, астма взрослых и тяжелая астма. Аллергия является вторичным по отношению к дефектам слизистой оболочки дыхательных путей при астме и кожного барьера у детей с экземой. Терапия только аллергии не будет эффективна. Предсказательная ценность генетических тестов низкая. Необходима идентификация внешнесредовых факторов. Обозначены мишени для эффективной терапии астмы. Исполнитель: Европейский консорциум Gabriel Сотрудничество: 164 ученых из 19 стран (23 исследовательских групп) Объекты исследования: астматиков (дети и взрослые) и здоровых индивидуумов.

8 ЛАБОРАТОРНАЯ И ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНА В настоящее время сложились новые предпосылки для переоценки роли лабораторной медицины в общей системе клинических дисциплин, что обусловлено требованиями, которые выдвигаются в связи со стремительным развитием современных подходов и принципов доказательной и персонализированной медицины, более глубоким пониманием характера междисциплинарных отношений.

9 ПОИСК НАИБОЛЕЕ ЗНАЧИМЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ БИОМАРКЕРОВ И Омы.

10 Основные задачи умных подходов Идентификация информационных объектов, таких как гены, белки, лиганды. Обнаружение отношений взаимодействия между объектами. Построение сетей и интегрирование различных подобластей – омов и комиксов.

11 ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАТИЧЕСКИХ И ДИНАМИЧЕСКИХ ОМИКов ГЕНОМИКА – ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ ГЕНОВ И МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К НАСЛЕДСТВЕННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ ИЛИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ ТРАНСКРИПТОМИКА – ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ МАТРИЧНЫХ РНК, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА мРНК И ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ЭКСПРЕССИИ ВСЕХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ У ДАННОГО ЧЕЛОВЕКА В ДАННЫХ УСЛОВИЯХ РНомика – ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ НЕКОДИРУЮЩИХ РНК И ИЗМЕРЕНИЕ ИХ У ДАННОГО ЧЕЛОВЕКА В КОНКРЕТНЫХ УСЛОВИЯХ МЕТАБОЛОМИКА – ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ МЕТАБОЛИТОВ В КЛЕТКАХ, ТКАНЯХ, ОРГАНАХ, БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ У ДАННОГО ЧЕЛОВЕКА В КОНКРЕТНЫХ УСЛОВИЯХ

12 МЕТАБОЛОМИКА

13 Метаболизм эстрадиола OH HO Эстрадиол HO O Эстрон HO O 2 -гидрокси сторон (2-ОН) HO OH O 16 -гидрокси сторон (16 -ОН) Ферментативная система цитохромов Р-450 Агрессивный сигнал Функциональный сигнал 2-гидрокси сторон (2-ОН) 16 -гидрокси сторон (16 -ОН)

14 Соотношение метаболитов эстрадиола 16 /2-OH - биомаркер развития патологической клеточной пролиферации в эстроген-чувствительных тканях

15 ИНДИНОЛ ® – регулятор метаболизма эстрогенов

16 ГЕНОМИКА. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ БИОМАРКЕРЫ.

17 Геномика – комплексная наука, изучающая геномы. Геном в последнее время рассматривается как открытая система, поэтому возникли новые разделы генетики: экогенетика, фармакогенетика, нутригенетика, токсико генетика, и др. Одно из интенсивно развивающихся в последнее время направлений-генетика популяций (популяционная генетика).

18 ГЕННЫЕ СЕТИ – ОСНОВА ПРЕДИКТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ ГЕННАЯ СЕТЬ – ЭТО ГРУППА КООРДИНИРОВАННО ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ ГЕНОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ФОРМИРОВАНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ ОРГАНИЗМА (МОЛЕКУЛЯРНЫХ, БИОХИМИЧЕСКИХ, ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ) Составление генной сети для каждого мультифакториального заболевания, идентификация в ней центральных генов и генов-модификаторов, анализ ассоциации их полиморфизма с конкретным заболеванием, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента составляют основу современной ПРЕДИКТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ.

19 СЕТЬ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА (Goh et al., 2007) КРУГИ – болезни; РАЗМЕРЫ КРУГА – число генов-кандидатов МФЗ (шкала - справа); ЛИНИИ - гены общие для нескольких МФЗ (толщина линий - соответствует числу генов)

20 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ

21 ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ (ГП) -ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ОГРАНИЧЕННАЯ ОДНИМ ВИДОМ К АЧЕСТВЕННЫЙ ГП ПРЕДСТАВЛЕН ПРЕИМУЩЕСТВЕННО ОДНОНУКЛЕОТИДНЫМИ ЗАМЕНАМИ (ОНП, SNP) КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ГП 1. ПРЕДСТАВЛЕН ВАРИАЦИЯМИ ЧИСЛА ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ (STR – Short Tandem). 1-2 либо 3-4 нуклеотидов на повторяющуюся единицу. 2. ПОВТОРЫ ДНК МОГУТ ИМЕТЬ И БОЛЬШУЮ ПРОТЯЖЕННОСТЬ И ВАРИАБЕЛЬНУЮ ПО НУКЛЕОТИДНОМУ СОСТАВУ ВНУТРЕННЮЮ СТРУКТУРУ VNTR (Variable Number Tandem Repeats) 3. CNVs (copy number variations) – вариации числа копий

22

23 Значимость анализа ОНП (SNP). Индивидуализированное определение уже известных SNP-профилей, ассоциированных с: – предрасположенностью к развитию мультифакториальных заболеваний: Кардиоваскулярные патологии Нейродегенеративные заболевания Злокачественные новообразования – индивидуальной чувствительностью к лекарственной терапии

24 ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛНОГЕНОМНОГО СКРИНИНГА АССОЦИАЦИЙ (GENOME WIDE ASSOCIATION SCREENING)

25 ТЕХНОЛОГИЯ СОЧЕТАЕТ ВОЗМОЖНОСТИ: ПРОГРАММЫ HapMap ТЕХНОЛОГИИ БИОЧИПОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ ( тысяч точек) СПЕЦИАЛЬНОЙ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ ОБРАБОТКИ РЕЗУЛЬТАТОВ С использованием GWAS уточнены геномные профили, найдены новые гены маркеры и идентифицированы неблагоприятные (редкие) аллели почти 10 мультифакториальных заболеваний: диабета 1-го и 2-го типов, болезни Крона, бронхиальной астмы, остеопороза и др.

26 Выявление «генов предрасположенности» к заболеванию проводится путем сопоставлений частот генотипов у больных и здоровых OR – количественная мера предрасположенности (Odd Ratio), показывает во сколько раз повышена вероятность заболеть для носителя «плохого» генотипа Группа больных Контроль (здоровые) - генотип, указывающий на предрасположенность к заболеванию. OR = ______________________ Р больные (1- Р контроль ) Р контроль (1- Р больные ) Р больные Р контроль >>

27 Распространенные аллели с большим эффектом, обнаруженные в GWAS (по Ch.S. Ku, 2010) Болезнь Наименован ие гена rsOROMIMРегион Возраст- зависимая дегенерация сетчатки CFH C q31 Эксфолиативная глаукома LOXL G q24.1 Болезнь КронаJL23R p31.3 Рак яичкаKILTG q

28 ТЕХНОЛОГИЯ БИОЧИПОВ НА ОСНОВЕ РАЗВИТИЯ НЕРАДИОИЗОТОПНОГО ГИБРИДИЗАЦИОННОГО, АМПЛИФИКАЦИОННОГО АНАЛИЗА И ДРУГИХ СОВРЕМЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ РАЗРАБОТАНЫ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ БИОЧИПЫ Основная доля производимых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы, то есть матрицы, несущие молекулы ДНК (94 процента, оставшиеся 6 процентов составляют белковые чипы): ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ И ИХ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ ПОЛИМОРФИЗМ ПО ЕДЕНИЧНЫМ НУКЛЕОТИДАМ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ УКАЗАННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ЯВЛЯЮТСЯ САМЫМИ ВАЖНЫМИ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ, И ИМЕЮТ НЕПОСРЕДСТВЕННОЕ ОТНОШЕНИЕ К ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЕ.

29 Классификация микро биочипов: - по биомаркерам (зондам), которые иммобилизуют на поверхность платформы (стекло, полимерные материалы, металлы, мембраны и др.) разделяют четыре основных вида биочипов: ДНК, РНК, белковые и клеточные. Кроме того, могут использоваться олигонуклеотиды, полисахариды, низкомолекулярные лиганды и др.; - по применяемым технологиям: матричная архитектура, гели, микрофлюидные (или капиллярные) и микросферы с цветовой кодировкой, квантовые точки и др.; - по области использования универсальные или специализированные для определенных медико-биологических задач или заболеваний; - по технологии нанесения биомаркеров: готовые олигонуклеотиды зонды или синтезируемые на поверхности биочипа; - по способу регистрации: радиоизотопные, не радиоизотопные, оптические, люминесцентные, хемилюминесцентные, электрохимические и др. методы детекции сигнала.

30 Результат анализа ДНК штаммов M. tuberculosis c использованием ТБ-БИОЧИП IS 6110 зонд ДНК «Дикого типа» His 526>Tyr (rpoB) Ser 315>Thr (katG) ТБ с МЛУ Обычная терапия Терапия вторым рядом ПТП IS 6110 зонд D.A. Gryadunov et al, Clin Microbiol Infect, 2005

31 Кардио-Биочип (Гены: AGT, REN, AGTR1, AGTR2, BKR2, MTHFR, ADRB2) Генотип: REN -83G>A функция фермента не изменена (G/G) AGT M235T функция фермента не изменена (M/M) AGTR1 1166A>C функция фермента не изменена (A/A) AGTR2 3123C>A (A/A) BKR2 -58T>C (T/C) MTHFR 677C>T функция фермента не изменена (C/C) ADRB2 48A>G (G/G) ADRB2 81C>G функция фермента не изменена (C/C) Повышенный риск артериальной гипертензии.

32 Фотолитография олигомеров на твердую подложку

33 Преимущества Affymetrix Высокая плотность = полное покрытие аннотированных генов и ОНП Максимально полное покрытие базы генов RefSeq многочисленными независимыми зондами Последние и полные версии ОНП баз данных До 10 млн. отдельных зондов на ОНП типе Высокая воспроизводимость данных Высокая специфичность связывания молекул Оптимальная длина зонда в 25 олигонуклеотидов позволяет уменьшить вероятность неспецифической гибридизации Методическая и техническая поддержка пользователя Развитые сервисы для анализа и обработки данных Широкая линейка систем Genome-Wide Human SNP Array 6.0: 1,8 млн маркеров: ОНП и для детекции вариаций числа копий (CNV)

34 ЭКСПРЕССИОННЫЕ МИКРОБИОЧИПЫ

35

36 Affymetrix Излечимые виды лейкозов дают одни узоры (паттерны), неизлечимые дают совсем другие паттерны. На рисунке можно видеть, как окрашенная ДНК от разных больных образует различные паттерны на биочипе. Болезнь одна и таже, паттерны разные. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней ее стадии. В данном случае при паттерне типа 1 верятность метастаз равна нулю, при паттерне типа 2 уже 29%, при паттернах типа 3 и 4 соответственно 75% и 77%.

37 Биочипы на основе микрофлюидумных технологий

38

39 ВОЗМОЖНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ BioMark ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ОТДЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ ОНП АНАЛИЗ CNV АНАЛИЗ ДНК СИКВЕНС ОТКРЫТАЯ СИСТЕМА: TaqMan, Roche UPL, интеркалирующие красители

40

41

42 4.2. Белковые микробиочипы.

43 Clontech

44 РНОМика Известно более двух тысяч микроРНК человека (miRBase), каждая из которых может регулировать работу сотен генов-мишеней. Микро-РНК (miRNA) – это класс малых РНК, которые кодируются генами и имеют длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации мРНК. Регуляция осуществляется путем комплементарного связывания микро-РНК с мишенями – частично комплементарными сайтами в нетранслируемых участках мРНК.

45 История открытия и развития исследований по микроРНК

46

47

48

49 РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФУНКЦИИ микроРНК МикроРНК – негативный регулятор экспрессии генов на посттранкрипционном уровне Один белоккодирующий ген может регулироваться десятками разных микроРНК Одна микроРНК может регулировать работу более сотни разных генов МикроРНК выступают как онкогены и супрессоры опухолей

50

51 Методический подход определения уровня экспрессии микроРНК в раковых клетках vs прилежащих нормальных клеток у одного пациента. Условная норма опухоль miR-155 miR-205 miR-21 miR-221 miR-222 U6 Схема детекции миРНК с помощью обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени

52 Микро РНК И ЗАБОЛЕВАНИЯ Согласно полученным данным количество различных микро-РНК у человека может достигать 37 тыс. (по сравнению с приблизительно 25 тыс. генов, кодирующих белок). Многие микроРНК принимают активное участие в развитии нервной системы и могут быть связаны с развитием нейродегенеративных заболеваний, изменяя профиль своей экспрессии при болезнях Альцгеймера и Паркинсона.

53

54

55 Концентрация miR-133b в различных отделах мозга у больных паркинсонизмом (PD) и у здоровых людей (control): СХ кора больших полушарий, МВ средний мозг, СВ мозжечок,. Хорошо видно, насколько содержание этой специфической микроРНК в среднем мозге у больных людей. Рис. из Kim J., Inoue K., Ishii J. et al.// Science. – – 317. – P

56 микроРНК И ОНКОЛОГИЯ микроРНК-21 – хронологически первая идентифицированная микроРНК. Является сильным онкогеном. Её экспрессия увеличивается в большинстве солидных опухолей. Увеличивает пролиферативную и инвазивную активность опухолевых клеток. микроРНК-221, микроРНК-222 – онкогенные микроРНК, индуцирующие ангиогенез и пролиферацию раковых клеток. микроРНК-155 – продемонстрировано участие этой микроРНК в инициации как врожденного, так и адаптивного иммунных ответов, а также в развитии иммунной системы в целом. Некоторые работы свидетельствуют об участии микроРНК155 в онкогенезе различной этиологии. микроРНК-205 – супрессор опухолевого роста, показано, что в случае некоторых видов опухолей микроРНК205 индуцирует апоптоз и тормозит рост опухоли.

57 МикроРНК при папиллярном раке и коллоидном узле щитовидной железы

58

59 Возможности микроРНК в диагностике опухолей Дифференцировать доброкачественные опухоли от злокачественных новообразований Контролировать эффект терапевтического воздействия (лучевая и химиотерапия) Ранняя диагностика Определение гистотипа опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию Прогностическое значение выживаемости

60 ТЕХНОЛОГИИ ПРОТОМИКИ Технология минисеквенирования с последующим анализом продуктов на MALDI- TOF-масс-спектрометре и дает возможность быстро и эффективно идентифицировать ОНП и обладает высокой производительностью В качестве матрицы, которая подвергается лазерному облучению (MALDI) находится ДНК в которых любые изменения (мутации, аллельные варианты) приводят к изменению массы.

61

62

63 Система, основанная на проточной цитометрии (xMAP-технология) Построена на использовании современнейших технологий: проточной цитометрии, микросфер из полистирола, маркированных красными и инфракрасными флуорофорами, лазерной детекции, цифровой обработки сигнала и традиционной химии, уникальным образом скомбинированных между собой. Микросферы покрыты захватывающими реагентами (олигонуклеотидами, антителами) и при смешивании образца с микросферами происходит их гибридизация или взаимодействие с пробами.

64

65 Генотипирование с использованием х-МАР технологии: CFTR, Factor V Leiden, Factor II (Prothrombin), Mitochondrial DNA Screening, MTHFR, P450-2D6, P450-2C9, P450-2C19, SSO A Locus, SSO B Locus, SSO DQB1, SSO DRB1, SSO DRB3,4,5, Y-SNP

66 ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ

67 В настоящее время можно выделить несколько направлений ГТ: преимплантационное, пренатальное, неонатальное, педиатрическое и терапевтическое для взрослого населения. Технологически ГТ осуществляется двумя методами, во- первых, таргетной диагностикой при наличии конкретных генетических полиморфизмов, и, во-вторых, полногеномного секвенирования. В первом случае исследуют конкретные генетические полиморфизмы: ОНП, CNV, вставки, делеции, дупликации и т.д. целевых генов или хромосомного региона. Полногеномные исследования применяют при заболеваниях с не совсем четкой клинической картиной, МФЗ, связанными с мутациями в нескольких генах, а также при проведении скрининговых исследований для выявления редких и не очевидных фенотипов.

68 ПОКАЗАНИЯ К ИССЛЕДОВАНИЮ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ К ГРУППЕ РИСКА СЕМЕЙНЫЙ ХАРАКТЕР ЗАБОЛЕВАНИЯ РАННЕЕ НАЧАЛО ЗАБОЛЕВАНИЯ ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ТЕРАПИИ

69 ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ (ГТ) в США, 2010 г. Всего ГТ наследственной предрасположенности применяется для 213 заболеваний Особенно часто оно проводится для таких заболеваний: рак толстого кишечника, диабет тип 2, глаукома, инфаркт миокарда, рак легких, рассеянный склероз, целиакия, рак молочной железы, ожирение, рак простаты, фибрилляция предсердий, диабет тип 1, болезнь Крона, гемохроматоз, волчанка, дегенерация сетчатки, остеоартриты, псориаз, рестеноз коронарных сосудов, болезнь «беспокойных» ног, тромбофилия

70 ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ

71 СЕКВЕНИРОВАНИЕ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ NEXT-GENERATION SIQUENCING (NGS) В 2005 ГОДУ ВОЗНИКЛИ ПЕРВЫЕ ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО ДНК СЕКВЕНИРОВАНИЯ, ОТКРЫВ ЭРУ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ; СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПУТЕМ СИНТЕЗА С ОБРАТИМОЙ ТЕРМИНАЦИЕЙ (ILLUMINA) ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЕ (ROCHE) СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПУТЕМ ЛИГИРОВАНИЯ (SOLID) ПОЛУПРОВОДНИКОВОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ (ION TORRENT) СЕКВЕНИРОВАНИЕ ОДНОЙ МОЛЕКУЛЫ (HELICOS GENETIC ANALYSIS SYSTEM) НАНОСЕКВЕНИРОВАНИЕ (COMPLET GENOMICS)

72 SOLiD System Инновации SOLiD TM Цена сиквенса генома человека Throughput (GB) SOLiD 3 System SOLiD System SOLiD 2 System 3GB 6GB 20GB SOLiD 4 & 4hq System upgrade

73 СЕКВЕНИРОВАНИЕ 2014 ГОД К гг. сложилась более ровная ситуация и целью является достижение цены секвенирования полного генома за 1000 долларов США. Фирма Life Technology представила в 2012 г. секвенатор Ion Proton, который должен был к концу года выйти на уровень 1000 долларов США за геном. Однако в настоящее время стоимость при анализе значительного количества образцов колеблется между 5000 и 4000 долларов США. Аналогичная попытка предпринята в 2014 г. фирмой Illumina при презентации секвенатора HiSeqX. В настоящее время происходит замена существующих технологий на более производительные: так Roche поглотила ряд перспективных молодых компаний и активно сотрудничает с Pacific Biosciences. В гг. в США появились первые рутинные диагностические методы, основанные на технологиях высокопроизводительного секвенирования, а секвeнатор MiSeqDx получил одобрение FDA по применению в медицинской практике.

74 ПЕРСПЕКТИВЫ ГТ В настоящее время ГТ применяется в диагностике наследственных, онкологических и некоторых МФЗ, однако весьма перспективно применение данных технологий в оценке микробиомного биоценоза человека. С точки зрения организации проведения исследований весьма перспективно создание крупных сервисных центров по секвенированию и накопления и обработки данных. По данным даным GenBank на протяжении последних 30 лет объемы данных о НП растут экспоненциально, обработка которых значительно отстает из-за недостатка биологических знаний и биоинформационных алгоритмов.

75 Генеральный директор компании Illumina, Джей Флэтли, заявил, что полное считывание ДНК для каждого новорожденного будет технически возможным и доступным менее чем за пять лет, что обещает революцию в здравоохранении и к 2019 году оно будет обычным делом.

76 Использование в ГТ циркулирующей в кровотоке матери внеклеточной ДНК плода (celf-free fenal DNA, cffDNA) Весьма перспективной технологией пренатального ГТ является использование циркулирующей в кровотоке матери внеклеточной ДНК плода, начиная уже с пятой недели беременности. По числу прочтений, которые относятся к исследуемой хромосоме относительно референсной, можно определить случаи анеуплодии, выявить пол будущего ребенка, хромосомные перестройки. Указанный метод в 2012 г. одобрен как дополнение к существующим протоколам в США, но назначается либо при высоком риске наследственных заболеваний, или по желанию. Если проводится высокопроизводительное секвенирования всей внеклеточной ДНК и матери и плода, то это дает возможность диагносцировать любое наследственное заболевание.

77 СЛОЖНЫЙ ГЕНОМНЫЙ ЛАНДШАФТ ОПУХОЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ NGS ПОКАЗАЛО ЧТО ОПУХОЛЬ ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ СОВОКУПНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ПРОФИЛЯМИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ. МОДЕЛЬ «ВЕТВЯЩЕЙСЯ ЭВОЛЮЦИИ»: ОПУХОЛЬ ИНИЦИИРОВАНА КЛЕТКАМИ, НЕСУЩИМИ ПЕРВИЧНУЮ МУТАЦИЮ, ЧЕРЕЗ НЕКОТОРОЕ ВРЕМЯ ДАЕТ НАЧАЛО ЦЕЛОМУ РЯДУ КЛОНАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ (ЛОМАЕТСЯ СИСТЕМА ЗАЩИТЫ ДНК) ТЕХНОЛОГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ЕДЕНИЧНЫХ КЛЕТОК ПОЗВОЛЯЮТ ВЫЯВЛЯТЬ РАЗНООБРАЗИЕ ИХ ГЕНОМНЫХ НАРУШЕНИЙ И ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСКРИПТОМОВ.

78 ГТ онкологических заболеваний С появлением ГТ онкологические заболевания рассматриваются как генетические, поэтому в диагностическом и терапевтическом плане весьма актуальным является использование рассматриваемых технологий секвенирования. К настоящему времени известно большое число онкогенов (более 400) и супрессоров опухолей. Сложность анализа генома при раке заключается в том, что 80-90% мутаций не наследственного характера, однако достаточно мутации в одной копии гена для того, чтобы клетка стала раковой. Такие доминантные онкогены обуславливают до 90% всех раковых заболеваний. Остальная часть приходится на мутации в генах-супрессорах, однако в этом случае мутировать должны обе копии гена-супрессора и такие мутации могут передаваться по наследству.

79 Онкогены и гены супрессоры Онкогены контролируют в нормальной клетке клеточный цикл и апоптоз и связаны с факторами роста и апоптоза, трансдукторами и транскрипционными факторами и мутации способствуют раковому перерождению. С другой стороны гены супрессоры опухолей ответственны за блокировку неконтролируемого клеточного роста и деления, запускают апоптоз или защищают геном от повреждений. Указанные гены-супрессоры в результате либо мутаций, либо эпигенетических изменений (например, метилирование) могут терять свои функции.

80 ГТ онкологических заболеваний По оценкам для злокачественной трансформации клетки в зависимости от типа рака необходимо от 3 до 12 мутаций. Некоторые мутации (TP53, KRAS и ряд других) выявляются в ряде опухолей, а некоторые тканеспецифичны (RB1). Технология высокопроизводительного секвенирования позволяет проанализировать все мутации генома опухолевой клетки в одном секвенировании экзома. Хотя опухоли часто генетически гетерогенны благодаря многократному прочтению генома даже редкие варианты могут быть идентифицированы.

81 Проекты в онкологии НОРВЕГИЯ: ЦЕЛЬ ПРОЕКТА СЕКВЕНИРОВАНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ КАЖДОГО ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ПАЦИЕНТА В СТРАНЕ. ПОЛУЧИЛ ПОДДЕРЖКУ ПРАВИТЕЛЬСТВА. НАЧАЛО: 2000 ПАЦИЕНТОВ ВОСЕМЬ ТИПОВ РАКОВ. ПРОЕКТ ЕС IT-FUTURE OF MEDICINE ОБЪЕДИНЕНИЕ ГЕНОМИКИ ТРАНСКРИПТОМИКИ, ПРОТЕОМИКИ, МЕТАБОЛОМИКИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ОБЩИХ ПРЕДСКАЩАТЕЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ВСЕХ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ПАЦИЕНТОВ В ЕВРОПЕ

82 БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ