Клхондау технологиясы және оның жетістіктері мен болашағы (6 дәріс) Клхондау (грек. clon – ұрпақ, бұтақ) денег сөз мағананы береді. Клон - организмдерді жыныссыз жолмен көбейту арқылы сол организмдерге фенотиптік және генотиптік бірдей ұрпақтар алуды айтады. Клхондау маманданған клеткалардың тотипотенттігі мәселесін шешуге көмектеседі

Жоғары сайтыдағы жануарларда өнімділікке жауап беретін, арнайы гендер кешені өте сирек туындайды, әрі келесі ұрпақтарда олар айтарлықтай өзгеріске ұшырайды және де алтын ұрпақ саны аз болады. Сонымен қатар, соматикалық жасуша аталған организмнің толық генетикалық ақпаратына ие екендігі белгілі, және егерь осы ақпараттың іске асуы үшін жағдай жасасақ, хонда белгілі бір дарақтың шексіз көп генетикалық көшірмелерін (клхондарын) алуға болады. Бірақ, көптеген сомалық жасушалардың ядро лары дифференцияланған күйде болатындықтан, бұл мәселені ұрықтың белгілі бір даму кезеңінде олардың дифференциациясы жүрмей тұрғанда, эмбриондық жасушаларда пайдалана отырып шешті. Бластомерлердің ядро ларын пісіп жетілген ооциттерге көшіру осындай мүмкіндіктер береді, себебі, ооциттер цитоплазмасы көшірілген адроны қайта бағдарлай алтын және жаңа эмбрионның даму бағдарламасын іске қосайтын спецификалық факторларға ие.

Клхондау тарихы 1826 жилы орыс эмбриологи Карл Бэр сүтқоректілердің жұмыртқа жасушасын ашты жылдары атақты орыс эмбриологи Г. В. Лапашов трансплантация әдісін қолдану арқылы бақаның аналық клетка сына ядро сын тасмалдаған, алайда жұмысы баспаға шықпады жылдары американдық Р. Бриггс пен Т. Кинг ұқсас тәжірибелер жүргізді.

Ұлыбританияның Оксфорд университетінің ғалымы ҰлыбританияныңОксфорд университетінің Д. Гердон ( жылдары) алғаш рет жануарды клхондауға болатынына қол жеткізді. Ол өзінің ядросы аллодын ала ультракүлгін сәулелері арқылы жойылған құрбақаның жұмыртқа клетка сына, ішек клеткаларынан алынған адроны ауыстыру арқылы әуелі итбалықты, соңынан сол ядро алған құрбақаға ұқсас дарабасты аллоды. Д. Гердон жилы Е.В. Конюхов пен Е.С. Платонов адроны тасмалдаудың жетілген микроманипуляциялық әдісін тапты. Онда аллодымен микропипетка мен пеллюцид зонасымен плазматикалық мембранный тесіп пронуклеусті шығарады, седан соң басқа диаметрі үлкендеу (12 мкм) пипеткамен диплоидты донор ядро сын сол тесік арқылы ендіреді. Бұл жағдайда ұрық цитоплазмасы мен донордың тасмалданушы ядросы аз бүлініске ұшырайды.

Бір клеткалы егіздерді алу. Бір клеткалы егіздерді алу мал шаруашылығында үлкен маңызға ие. Бір жағынан бір донор дан шығатын төл саны көбейеді, екіншіден – екі генетикалық жағынан бірдей егіздер алынады. Бірдей егіздерді көп мөлшерде алу бұқаларды, ұрпақтың сапасына қарай, бағалауды жеңілдетеді, сперма өндірудің бағасын төмендетті. Бір жұмыртқалы тышқандардың алғашқы ұрпағы механикалық изоляцияланған екі жасушалы эмбрихондар бластомерлерінен 1970 жилы алынды. Осы техниканы қолдана отырып, бірақ агарға его әдісін қолдана отырып С.М. Вилладсен (1979) қойларда 2- клеткалық эмбрихондарды бөлу арқылы бір жұмыртқалы егіздерді алуды сипаттады.

Мал шаруашылығы үшін бір жұмыртқалы егіздер алудың үлкен маңызы бар. Бір жағынан саны өседі, әрі генетикалық бірдей егіз алынады. Жануарлар биотехнологиясы тәжірибеде «құрастырылған» жануарларды алу технологиясының екі түрі бар: түрішілік және түраралық. Түрдің ішінде «құрастырғанда» клхондалған, түрлердің арасында «құрастырғанда» - химералық жануарлар алынады. Клхондалған жануарларды алу екі әдістен тұрады: имплантацияға дайындалған ұрықтың диссекция әдісі және энуклеация әдісі. Табиғи монозиготалы егідердің пайда болу мүмкіндігі 0,01%-тен аспайды.

Дисекция әдісі Дисекция әдісі монозиготалы жануарлар алу негізіне бластомераның ұрықтан бөлінгенде тіршілікке және қабілетін жоғалтпайтыны, оның барлық онтогенез сайтыларын өтіп, толық организме дейін дамы аллы қасиеті (тотипотенттік) жатыр. Сүтқоректілердің бластомерлерінің тотипотентілігі бірінші рет тышқан эмбрихондарында дәлелденген жилы 8-16-жасушалық даму сайтысында алынған 80 деми-эмбрионды тасмалдау арқылы 30 тышқан алынған. Мұнда пеллюцид зоналары алынып тасталған. Мал шаруашылығында эмбрион клхондарын алу мүмкіндігін Ф.Сиделдің қояндарға жасаған тәжірибелері көрсетті

Қойларда 2-клеткалық эмбрихондарды тек қана өте қысқа уақыт көлемінде алуға болады. Қойлардан тек кейбір бөлініп жатқан эмбрихондарды іздеу (күйіт) басталғаннан кейін 48 сағатқа дейін бөлініп аллоды, ал 60 сағаттан кейін эмбрихондардың көпшілігі 4-клеткалық даму сайтысында болады. Кейінгі зерттеулер бірдей егіздерді бластомерлерді екі топқа бөлу арқылы 4- және 8-клеткалық эмбрихондардан алуға болатындығын көрсетті (С.М. Вилладсен, 1980). 2-, 4- және 8-клеткалық эмбрихондар, қойлардың қалыпты эмбрихондары сияқты, тіршілікке қабілетті.

Қазіргі уақытта эмбрихондардың дамуының әртүлі кезеңінде (кеш моруладан бластоциста жарылып шыққанға дейін) пеллюцидтер зона сын кису арқылы екі бірдей бөлікке бөлу арқылы қарапайым техниканы қолданады. Ал, пеллюцидті зонаның бөлінген бластоцистаның дамуының тиімділігінде айтарлықтай рөлі анықталмаған. Ірі қараларда бір жұмыртқалы егіздерді алу үшін эмбрихондарды дамудың кеш кезеңінде қолдану, оларды хирургиялық емс жолмен алуға болатындығы жеңілдетеді.

Бөлудің қарапайым техникасы шошқаның 6 күндік эмбрихондарына да жасалған. Бұл кезде шины именин эмбрионның ішкі жасушалық масса сын және 40% пеллюцид зона сын кеседі. Одан кейін пеллюцид зона сының ішіндегі трофоэктодермалық қабатты кеседі. Эмбрионның бір жартысын өзінің пеллюцидті зона сына, ал екіншісін пеллюцидті зона сынсыз жатыр-түтіктік байланысқан 5 см қашықтықта 6 күндік реципиенттің жатыр мүйізіне көшіреді. Жарты эмбрихондарға бөлу техникасы қойлар мен ешкілерде сәтті қолданылып келеді.

Эмбрихондарды бөлу техникасының қарапайымдалынуы екі негізгі себепке байланысты: 1) агарға енгізу техникасынан және уақытша реципиенттерді пайдаланудан бас тарту; 2) мөлдір қабықтан бөліп алу және оған операция жасалған эмбрихондарды ретрансплантациялау кезеңдерін алып тастау. Бір жұмыртқалы егіздерді алу үшін аралық материал ретінде соңғы уақытта 5,5-8 күндік арте морула- бластоциста кезеңіндегі эмбрихондарды қолданады.

Эмбрионның ядро сын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыру арқылы эмбрихондарды клхондау Соңғы жылдары эмбрихондардың ядро сын энуклеирленген жұмыртқа (ядросы алып тасталған) жасушасына ауыстыру монозиготалы егіздер алуда кеңінен қолданылады. Бұл әдіс – адроның плюрипотенттілігіне негізделген.

Эмбрионның ядро сын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыру арқылы эмбрихондарды клхондау үш негізгі сайтылардан тұрады: Біріншісі, ұрғашы донордың жыныс жолдарынан 2-8 бластомералық бөліну кезеңіндегі ұрықтарды бөліп алу; пеллюцид зона сынан шығару. Ал бұл әдістің екі жолы бар: микроманипулятордың көмегімен механикалық бөлу және фермент проназаның көмегімен ферменттік әсер ету арқылы бөлу. Содан кейін ұрықты бөлек бластомераларға бөліп, олардан интакты донор ядро сын алу;

Екінші сайты, ооцитті энуклеация жасау; Энуклеация әдісінде овуляция дан өткен жұмыртқа жасушаны донордың жыныстық жолынан алып, микроименин ұрықтандырылған жұмыртқа жасушаны кесіп цитохалазин қосылған фосфаттық ортаға саллоды. Пипеткамен поляры денені және оның қасындағы цитоплазмоны бір сағат культивирлеуден кейін сорып аллоды. Сонымен жұмыртқа жасушасы екіге бөлінеді. Полярлы дененің бар жартысында метафаза ІІ кезеңіндегі хромосома лары бар (жұмыртқа жасушаның «ядролық» жартысы).

Екінші бөлекте ядролық құрылымдары жоқ («энуклеирленген» жарты). Үшінші сайты, бөлініп алынған бластомера ядро ларын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына инъекциялау. Сүтқоректілерде амфибияның (Rana pipiens) ядро сын ауыстырғаннан өзгешелігі ооцитті қоздыруды (стимул дэу) керек етеді, сондықтан төртінші кезең болып ооциттің активациясы, яғни электрлік импульстің әсерімен донордың жасуша ядросы мен энуклеирленген реципиент-ооциттің мембранасының құйылысуы табылады. Осылай реконструкция дан өткен ұрықтарды культивирлеу үшін реципиентке ендіреді. Ұрықтарды бластоциста кезеңіне дейін өсіреді. Кейіннен лапаротомия әдісімен бластоцистаны жұмыртқа жолынан алып, қапталған ограды алып тастап, ұрықты бағалайды.

Осындай әдіспен алған жануарларды монозиготтық егіздер деп атайды. Бұл технология арқылы, тірі қояндар, тышқандар, қойлар, қозылар, сиырлар мен шошқалар алынған. Ірі қараның эмбрихондарын ірі көлемде клхондауды АҚШ және Канададағы екі коммерциялық фирмалар жүргізді. Бірінші жағдайда донор-ядроларды клеткалық эмбрихондардан аллоды, екінші жағдайда – 8-64-клеткалық эмбрихондардан аллоды. Екі жағдайда да ооциттерді іздеу басталғаннан кейін сағаттан кейін суперовуляциясы туындаған сиырлардан алынды, ал эмбрихондарды хирургиялық емс жолмен бөліп аллоды.

Жануарларды соматикалық жасуша ядро сын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыру арқылы клхондау Эмбрихондардың ядро сын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыру арқылы жануарларды клхондаудан алынған тәжірибелер соматикалық жасуша ядро ларын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыруға негіз баллоды. Бұл екі әдістің де қағидасы өз-ара бірдей жануарларды клхондау бокса, бұл әдіспен алынған жануар соматикалық жасушаның донорлық генотипімен бірдей болады. Жануарлар клоны алу тәсілінің айғағы болып Долли қойы жатады. Бұл қойды сүт безінің эпителий жасушасынан алынған адроны тасмалдау арқылы Вильмут (Wilmut et al., 1997) алған.

Ядроны қойларда ауыстырудың тағы бір қолайлығы қойлардың ұрық эмбриогенезінің ерекшелігінде болып отыр. Қой ұрығының алғашқы үш бөлінуі бірнеше күнге созылады, бірде-бір ген экспрессияланбайды, тек ДНҚ репликациясы ғана жүреді. Міне, осы уақытта бөтен трансгенді адроны ауыстыруға болады. Сол уақыттан бері әлемде көптеген зертханалар жануарлар жасушаларын қайта бағдарлау бағытында жұмыс істейді. Мысалы: сүт бездерінің, құлақтың жасушаларының ядро ларын ауыстырумен айналысады. Мысалы, осы жолмен (Wells et al 1999 ж.) Исландия түбегінде қалған бірнеше сирек кездесетін субтропикалық ірі қараның самкасының генетика сын сақтау мақсайтымен соматикалық ядросы ауыстырып бұзау аллоды.

жылдаржануаржылдаржануар 1970 амфибия 2004 коммерциялық мақсаттағы алғашқы мысық 1885 сүйекті балық2005 алғашқы ит (Снуппи) 1996Долли қойы 2006 алғашқы күзен 1997 алғашқы тышқан 2007 екінші ит 1998 алғашқы сиыр 2008үшінші ит (Чейс) 1999 алғашқы ешкі2009 алғашқы түйе, алғашқы ешкі 2001 алғашқы мысық2011 койот күшіктері 2002 алғашқы қоян 2003 алғашқы бұқа, бұғы Клхондау технологиясының қысқаша хронологиясы

2001 жилы ең алғашқы Гор атты жойылып бара жатқан жабайы бұқа клхондаллоды. Бұл жабайы бұқа туылғаннан кейін 48 сағаттан соң жұқпалы аурудан өліп қаллоды. Сол жилы италяндық ғалымдар жойылып бара жатқан жабайы ешкінің дені сау ұрпағын клхондады. Клхондалған жануар қазіргі күні Сардиния қаласының жабайы табиғатының ортасында тіршілік етуде. Жойылып бара жатқан жануарлардың ішіндегі клхондалтын негізгі жануарлар – Африкандық Бонга антилопасы, Суматра аралындағы жолбарыс, Гигант пандасы.