Свободные радикалы. Образование и метаболизм Ю.А. Владимиров Медико-биологический факультет РГМУ Факультет Фундаментальной Медицины МГУ

Что такое свободный радикал ? неспаренный электрон Свободный радикал - это молекулярная частица, у которой на внешней оболочке имеется хотя бы один неспаренный электрон. C H O H H H метанол Радикал может образоваться из молекулы при ее окислении, например при отрыве атома водорода (т.е. электрона и протона) CO H H H радикал метанола

Электронная структура некоторых радикалов DioxygenDioxide (superoxide) +e ¯ ( ) OO OO ()¯)¯ O 2 + e¯ ·OO¯ Гидроперекисный радикал +H++H+ OO OO ()¯)¯ H ·OO¯ + H + ·OOH ·OOH + e¯ + H + HOOH Гидропероксид водорода

Биохимические Маркеры Диеновая коньюгация Ингибиторный анализ Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) Прямое обнаружение радикалов Метод спиновых ловушек Хемилюминесценция Собственная Активированная Методы изучения реакций с участием свободных радикалов Липидные системы Липопротеины крови АОА веществ Клеточная ХЛ Диагностика Действие лазеров

Хемилюминесценция при цепном (перекисном) окислении липидов

HOH LH HOL Инициирование цепи LOO OO Продолжение цепи Цепное окисление липидов LOO + InH LOOH + In Обрыв цепи OO LOO LH L Звено цепи LOOH Цепному окислению подвергаются жирные кислоты, углеводородные цепи которых содержат двойные связи. Окисление начинается с отрыва атома водорода в метиленовой группе рядом с двойной связью: CH 2 CH = CH Обозначим эту группу как LH.

HOH LH HOL Initiation OO LOO LH LLOO OO Propagation Termination LOH LOOH LH LO Fe 2+ Fe 3+ OO L LOO Branching New chain Реакции цепного окисления липидов

ХЛ и [O 2 ] (отн. ед.) Время инкубации, мин Коррелляция между цепным окислением липидов и ХЛ в суспензии митохондрий к которым добавили ионы Fe 2+.

Коррелляция между образованием продукта пероксидации (МДА) и ХЛ в суспензии митохондрий d[МДА] dt Хемилюминесценция Условные единицы Время инкубации, мин

Fig. 8 (1971)

Реакции, ответственные за хемилюминесценцию PM Ось Fe 2+ Ось PM LOOH Fe 2+ + LOOH LO + Fe 3+ LO + LH LOH + L В вакуме: L + O 2 LOO LOO + LOO L=O + LOH На воздухе:

Вспышка свечения при взаимодействии Fe 2+ с окисленными липидами Олеиновая кислота В вакууме На воздухе Митохондрии В вакууме На воздухе Fe 2+

Измерение ХЛ – прямой метод определения радикалов LOO· в биохимических системах LOO· + LOO· LOH + L=O* + 1 O 2 L=O* L=O + фотон 1 O 2 3 O 2 + фотон Недостатки ХЛ метода: 1. Свечение очень слабое. 2. Свечение неспецифическое. В результате: Неизвестно, измеряем ли мы нужные нам процессы или же побочные реакции.

Хемилюминесценция при образовании активных форм кислорода

Основоположники Robert Allan. Открыл ХЛ нейтрофилов в 1971 году. A.U. Khan. Открыл ХЛ при реакции гипохлорита с H 2 O 2 в 1970 г. Юрий Владимиров (1959). Сверхслабое свечение животных тканей. Берлин 1997

Супероксидный радикал Встретив чужеродную частицу, например, бактерию, фагоцит прикрепляется к ней и начинает выделять активные формы кислорода, первая из которых - супероксидный радикал. НАДФН + 2О 2 НАДФ + + 2(О 2 ¯) Реакция катализируется ферментным комплексом НАДФН оксидазой, который встроен в цитоплазматическую мембрану. Основной источник супероксидных радикалов в нашем организме - клетки-фагоциты, к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, и тканевые макрофаги. Фагоцит

Метаболизм супероксидного радикала 1)2 ·OO¯ H 2 O O 2 (Супероксиддисмутаза) 2)2 ·OO¯ H 2 O O 2 (Спонтанно) 3) 1 O 2 3 O 2 + фотон (1268 нм) 4)H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 (Каталаза) 5)H 2 O 2 + Cl¯ H 2 O + ClO¯ (Миелопероксидаза) 6)H 2 O 2 + ·OO¯ + H + H 2 O + ·OH + 1 O 2 (Реакция Габер-Вейса) 7)H 2 O 2 + Fe 2+ HO¯ + Fe 3+ + ·OH (Реакция Фентона) 8)ClO¯ + Fe 2+ Cl¯ + Fe 3+ + ·OH (Реакция Осипова)

Судьба супероксидного радикала и нитроксида OONO (пероксинитрит) 5 Интоксикация. OO¯ Антимикробное действие СОД O 2 + H 2 O 2 2 каталаза пероксидазы Детоксикация H 2 O 2 4. NO Вазодилатация 1 Cl¯ миеллопероксидаза ClO¯ 3 6 LOOH HOOH HClO Fe 3+ Fe 2+ 7 LO HO Токсическое действие

Хемилюминесценция через стадию образования эксимеров кислорода Обзор: J. Stauff et al. in Chemiluminescence and Bioluminescence (M. Cormier et al., eds), Plenum, NY, H 2 O 2 + ·OO¯ H 2 O + ·OH + 1 O 2 1 O 2 1 O 2 + фотон (1268 нм); O O 2 (O 2 ) 2 * (O 2 ) 2 * 2O 2 + фотон (480, 535 и 580 нм) HO ¯O¯O C O + ·OH ·O·O ¯O¯O CO + HOH 2(·CO 3 ¯) 2CO O 2 свечение Гипотетическая схема

Активированная ХЛ 1. Химические активаторы (Sensitizers)

Два типа активаторов ХЛ – CL enhancers Химические активаторы – chemiluminogenic probes Вступают в реакцию с образованием продуктов в эектронно-возбужденном состоянии. Физические активаторы – sensitizers Не вступают в химические реакции, но увеличивают квантовый выход испускания фотона.

Активировированная ХЛ лейкоцитов Вспышка ХЛ при добавлении стимула к нейтрофилам. 1- без активатора, 2 – с люминолом. Число клеток: 1 = , 2 = Чувтсвительность: 1 = 20, 2 = 1. Yu. A. Vladimirov, S. R. Ribarov, P. G. Bochev, L. C. Benov, and G. I. Klebanov. Gen. Physiol. Biophys. 9 (1):45-54, клеток, + люминол клеток, без активатора Люминол N¯N¯ NH O O NH2NH2

Люминол реагент на гидроксил- радикал и гипохлорит. N N O OH NH 2 · OO¯HO O O O¯O¯ O¯O¯ NH 2 N¯N¯ N H O O NH 2 Luminol-anion Luminol-radical N N O OO¯O¯ NH 2 ¯O¯O - Luminol hydroperoxide N N O¯O¯ NH 2 O¯O¯ O O Luminol-dioxide + фотон O¯O¯ O O NH 2 3-aminophtalate O¯O¯

Люцигенин реагент на супероксид. сине-зеленая люминесценция + ROOH или R=O + фотон N X¯X¯ R CH 3 NH2H2 люцигенин N X¯X¯ O CH 3 + HOOH в щелочной среде

Хемилюминесценция при окислении ксантина Время, с ХЛ сигнал, мВ 1256 – sucr-TRIS+100 mcL lucigenin+100mcL xantin 1346 – + XO less than 100 mcL 1686 – 100 mcL lucigenin 1804 – 100 mcL lucigenin 1926 – 50 mcL SOD 2036 – off lucigenin + xantin XO lucigenin SOD

Хемилюминесценция митохондрий

Место образования супероксида в митохондриях FIG. 8. Scheme illustrating the effects of mitochondrial electron transport inhibition on superoxide generation. Sites of inhibition are indicated with boxes. J. Duranteau N. S. C., A. Kulisz, Z. Shao, and P.T. Schumacker, Intracellular Signaling by Reactive Oxygen Species during Hypoxia in Cardiomyocytes, JBC, 273(19): (1998).

Активированная ХЛ 2. Физические активаторы (Sensitizers)

Активированная ХЛ. Физические активаторы. Квантовый выход ХЛ ( ХЛ ): Многие химические реакции сопровождаются очень слабым свечением. Почему оно слабое? 10 – 4 10 – 8

Хинолизин кумарины физические активаторы C-334 R = C-314 R = C-525 R = кумарин

Механизм физической активации ХЛ >C=O* Липидные радикалы = = 0.1 – 1.0 C-525 *

Lipid peroxidation Fentons reaction Concentration of C-525, M Cemiluminescence Активация ХЛ кумарином C –9 10 –8 10 –7 10 –6 10 –5 10 –

Усиление ХЛ кумарином C Time, min nM 20 nM Fe 2+ A Chemiluminescence (arb. Unit) 0 nM Time, min M M 8.4 M 0 M B Следующая презентация