Учреждение российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Генетический контроль радиочувствительности у человека А.В. Рубанович

Почему нужно изучать «генетику радиочувствительности»? Прикладные аспекты: Полет на Марс: суммарно за 3 года не менее 1,2 Зв Профессиональный отбор на основе индивидуального генотипирования Индивидуализация радиотерапии Диспансеризация лиц, облученных в результате профессиональной деятельности или проживающих в радиационно-загрязненных районах

Почему нужно изучать «генетику радиочувствительности»? Общебиологические аспекты: Генетика количественных признаков Причины распространения и поддержания в популяциях потенциально опасных генотипов Наследование и изменчивость неспецифической устойчивости

Как проявляется изменчивость индивидуальной радиочувствительности? Донор 1 Донор 2 6 аберраций на 100 клеток 20 аберраций на 100 клеток Облучение in vitro: 1 Гр Донор 1 более устойчив? Различия по частоте аберраций – это стохастика «попадания» или результат дифференциальной радиочувстительности? Различия высоко значимы по точному критерию Фишера: р=0,0054 Обычно имеют в виду следующее:

>6 Частота спонтанных аберраций на 100 клеток Частота, % аберраций Пуассоновское распределение Группа людей с низким уровнем спонтанных аберраций Группа людей с высоким уровнем спонтанных аберраций Распределение частот спонтанных аберраций хромосом в лимфоцитах крови большой группы доноров (реальные данные, 250 доноров) Различия высоко значимы по точному критерию Фишера! Группа людей с предрасположенностью к соматическому мутированию??? Совсем не обязательно! Необходимо сравнить с пуассоновским распределением (с таким же средним) Если различия значимы, то в этой группе есть люди с повышенной частотой аберраций А в этой группе вероятно есть устойчивые к соматическому мутированию Но это лишь косвенное доказательство существования изменчивости индивидуальной радиочувствительности! Однозначный ответ могут дать только сравнения дозовых зависимостей выхода хромосомных аберраций отдельных доноров

Что свидетельствует о генетическом характере изменчивости индивидуальной радиочувствительности? Высокая радиочувствительность клеток при некоторых тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксия- телеангиэктазия) Изменчивость реакций тканей при радиотерапии Различная радиочувствительность хромосом у носителей различных широко распространенных генотипов Прямые доказательства: Основная тема нашего разговора Единственный регулярный источник данных о радиационном поражении in vivo на уровне организма Единственное неоспоримое доказательство

Кариотип донораДиагноз Относительная радиочувствительность хромосом 46,XYАтаксия телеангиэктазия (АТ) 1,91 0,17* 46,XX Гетерозиготное носительство генов АТ (практически здоровы) 1,31 0,05* 46,XY 1,30 0,06* 46,XY 1,14 0,09 46,XXПрогерия 1,56 0,06* 46,XY Синдром Паркинсона 0,98 0,06 46,XY 0,94 0,08 46,XX 1,23 0,05* 46,XX, rcp(5;13)Практически здорова 0,92 0,04 45,XX, -14,-21,+rob(14;21)Практически здорова 1,16 0,06* 46,XX, 5 p - Синдром кошачьего крика 0,92 0,04 46,XX – 40% Синдром «18q - » 1,10 0,08 45,XX, -13, -18,+der(18) rcp (13;18) -60% 1,12 0,08 47,XY,+21 Синдром Дауна 1,72 0,06* 47,XY,+21 1,50 0,05* 47,XY,+21 1,16 0,07 47,XY,+21 1,24 0,07 47,XY,+21 1,24 0,09* 47,XY,+21 1,45 0,04* 46,XX – 33%~1,2* 47,XX,+21 – 67%~1,8* 45,X0Синдром Шерешевского-Тернера 1,57 0,10* Сравнительная радиочувствительность хромосом при генных, структурных и числовых мутациях (Е.К. Хандогина, 2009) Отношение площадей под кривой выхода аберраций в клетках обследуемого донора и соответствующей контрольной кривой при облучении в диапазоне 0,25-3 Гр Частота гетерозигот по гену АТМ доходит до 3%. Выход аберраций повышен на 30% Выход индуцированных хромосомных аберраций у больных атаксией и синдромом Дауна повышен в 1,5-2 раза Для каждого донора построена кривая выхода аберраций при облучении в диапазоне 0,25-3 Гр

Кариотип донораДиагноз Относительная радиочувствительность хромосом 46,XYАтаксия телеангиэктазия (АТ) 1,91 0,17* 46,XX Гетерозиготное носительство генов АТ (практически здоровы) 1,31 0,05* 46,XY 1,30 0,06* 46,XY 1,14 0,09 46,XXПрогерия 1,56 0,06* 46,XY Синдром Паркинсона 0,98 0,06 46,XY 0,94 0,08 46,XX 1,23 0,05* 46,XX, rcp(5;13)Практически здорова 0,92 0,04 45,XX, -14,-21,+rob(14;21)Практически здорова 1,16 0,06* 46,XX, 5 p - Синдром кошачьего крика 0,92 0,04 46,XX – 40% Синдром «18q - » 1,10 0,08 45,XX, -13, -18,+der(18) rcp (13;18) -60% 1,12 0,08 47,XY,+21 Синдром Дауна 1,72 0,06* 47,XY,+21 1,50 0,05* 47,XY,+21 1,16 0,07 47,XY,+21 1,24 0,07 47,XY,+21 1,24 0,09* 47,XY,+21 1,45 0,04* 46,XX – 33%~1,2* 47,XX,+21 – 67%~1,8* 45,X0Синдром Шерешевского-Тернера 1,57 0,10* Отношение площадей под кривой выхода аберраций в клетках обследуемого донора и соответствующей контрольной кривой при облучении в диапазоне 0,25-3 Гр

Почему использовано отношение площадей под кривыми доза-эффект? y=k 0 D y=kD D Частота аберраций S S0S0 В нелинейном случае отношение площадей – это отношение средних показателй выхода аберраций на единицу дозы S/S 0 =k/k 0 Кстати для выживаемости: площадь под кривой выживания (в линейном масштабе) равна средней «убивающей» дозе Выживаемость, % D LD 50 - средняя доза, вызывающая гибель _ D = Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек, по сравнению с алгоритмом вычисления LD 50 Радиобиологи вместо понятия «средняя продолжительность жизни» ( ) любят использовать «возраст, в котором умирает каждый второй» (LD 50 ) _ D

Высокая радиочувствительность клеток при некоторых тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксия- телеангиэктазия) Изменчивость реакций тканей при радиотерапии Различная радиочувствительность хромосом у носителей различных широко распространенных генотипов Прямые доказательства: Что свидетельствует о генетическом характере изменчивости индивидуальной радиочувствительности?

18 2% - средняя частота случаев тяжелого поражения кожного покрова 41%49%9% В выборке из 427 больных Результаты радиотерапии больных раком молочной железы Частота случаев прекращение курса радиотерапии из-за тяжелого поражения кожного покрова C. Ambrosone, C. Tian, et al. Genetic predictors of acute toxicities related to radiation therapy following lumpectomy for breast cancer: a case-series study. Breast Cancer Research, из 427 (18%) 47 из 446 (11%) O. Popanda, Xiang-Lin Tan, et al. Genetic Polymorphisms in the DNA Double-Strand Break Repair Genes XRCC3, XRCC2, and NBS1 Are Not Associated with Acute Side Effects of Radiotherapy in Breast Cancer Patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2006 Полиморфизмом гена GSTP1 можно объяснить 35% изменчивости реакции на радиотерапию …но лучше этого не делать!

Что свидетельствует о генетическом характере изменчивости индивидуальной радиочувствительности? Высокая радиочувствительность клеток при некоторых тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксия телеангиэктазия) Изменчивость реакций тканей при радиотерапии Различная радиочувствительность хромосом у носителей различных широко распространенных генотипов Прямые доказательства: Обусловлена редкими мутациями. Тестируя кандидатов в космонавты, вы их не найдете! Частично обусловлены генетической изменчивостью, т.е. полиморфизмом генов

Генетическая изменчивость или полиморфизм генов – одновременная встречаемость в популяции различных вариантов генов (аллелей) Вспомним терминологию: Полиморфизм – ген представлен в популяции двумя и более аллельными вариантами. При этом частота более редкого (минорного) аллеля > 5% Мутации – редкие (< 1%) и обычно вредные аллели

Виды генетического полиморфизма SNP – Single Nucleotide Polymorphism - однонуклеотидные замены оснований в ДНК Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный. Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок. Дупликации – в популяции встречаются хромосомы с несколькими копиями одного гена S TR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов (микро- и минисателлиты). Нейтральная изменчивость в некодирующей части ДНК. GSTM1 15 Кб GSTT1 54,2 Кб Делеции генов детоксикации ксенобиотиков: - каждый второй … и каждый пятый из нас! CNV – copy number variations

Последовательность с заменой С Т (или G A ) - 40% - 50% - 10% Обозначение: MTHFR С677T (677-положение нуклеотида) Фенотипы: нормальная обычно пониженная активность активность фермента A C CGGGAGCCGATTT - аллельный вариант С (мажорный, предковый) Т CGGGAGТCGATTT - аллельный вариант Т (минорный, мутантный) SNP - однонуклеотидные замены оснований в ДНК - первопричина генетической изменчивости (2005) C GCCCTCGCTAAA CGGGAGCGATTT G Полиморфизм – одновременная встречаемость в популяции обоих вариантов (с частотой > 5%): GCCCTCGCTAAA T CCGGGAGCGATTT G Нормальная последовательность (в гене MTHFR) Генотипы: С/C C/T T/T Реальный пример: SNP в экзоне гена MTHFR. 5,10-метилен тетрагидрофолатредуктаза, Фермент 5,10-метилен тетрагидрофолатредуктаза, ответственный за метилирование ДНК и синтез тиминов. Аллель Т часто сопряжен с предрасположенностью к онкозаболеваниям

База данных гаплотипов SNP для 4 популяций ( по 100 человек) 18961_c1AATATGCCTTAGAGTGGGTGTAGCACGTATCGCAGCACGG 18963_c2AATATGCCTTAGCGTGGGTGTAGCACGTATCGCAGCACGG 18976_c1AATATGCCTTAGCGTGGGTGTAGCACGTATCGCAGCACGG 19056_c2AATATGCCTTAGAATGGGTGTAGCACGTATCGCAGCACGG 19059_c1AATGCGCCCCATCATAGGTGTGATGCGCCTCACGGCGTGA 18977_c1AATGCGCCCCATCATAGGTGCGACGCGCCTCACGGCGTGA 19065_c2AATGCGCCCCATCATAGGTGCGACGCGCCTCACGGCGTGA Полиморфен каждый десятый ген с частотой встречаемости аллелей до 50% Мы отличаемся друг от друга в среднем каждым тысячным нуклеотидом ( двумя на 1000) Описаны SNP (MAF>5%) и SNP (1%

Оценки радиочувствительности: частоты аберраций хромосом экспресс-цитогенетика: микроядра, СХО уровень TCR-мутантных лимфоцитов длины хвостов комет Кандидатные полиморфизмы: гены репарации ДНК гены детоксикации ксенобиотиков и оксидативной защиты гены клеточного цикла и апоптоза ? XRCC1, XRCC3, APE, XPD, XPG, XPC, RAD51, OGG1 MTHFR, p53, CCND1 CYP1A1, CYP2D, GSTM1, GSTT1, GSTP1, SOD2, MDR1, NAT2 Как выявить сопряженность (корреляцию, ассоциацию) частот аберраций и генотипов? Далее потребуется статистический анализ

Статистический анализ сопряженности частот аберраций и генотипов Частота аберраций хромосом A/GA/GG/GG/GA/AA/A + Рецессивная модель + Доминантная модель Самое простое и необходимое: вычисление средних частот аберраций для носителей различных генотипов. Далее сравнение по непараметрическому тесту (не по Стьюденту!) Гомозигота по мажорному аллелю Гомозигота по минорному аллелю Обычно стараются рассмотреть две группы

Частота аберраций на 100 клеток Частота, % 6060 Сравнение частот генотипов для групп с низким (или высоким) уровнем аберраций Самое простое и необходимое: вычисление средних частот аберраций для носителей различных генотипов. Далее сравнение по непараметрическому тесту (не по Стьюденту!) >6 Частота аберраций на 100 клеток Частота, %, Группа людей с нулевым уровнем аберраций A/A A/G G/G A/A A/G G/G Далее вычисляются относительные риски (OR) и значимость по точному критерию Фишера. В данном примере риск возникновения аберраций у носителей минорного аллеля G равен OR=2,1 и р=0,015 Статистический анализ сопряженности частот аберраций и генотипов

OR – непременный атрибут «case-control association study» (выявление «генов предрасположенности» к заболеванию путем сопоставлений частот генотипов у больных и здоровых) OR – количественная мера предрасположенности (Odd Ratio) Группа больных Контроль (здоровые) - генотип, указывающий на предрасположенность к заболевания OR = ______________________ Р больные (1- Р контроль ) Р контроль (1- Р больные ) Р больные Р контроль >> OR>1 – генотип связан с болезнью OR=1 – нет связи между генотипом и болезнью OR

Сравнение частот генотипов для групп с низким (или высоким) уровнем аберраций Логистическая и пуассоновская регрессии р – частота аберраций x i – генотип i-го локуса а i – коэф. регрессии Зависимая переменная – частота (р), независимыми переменные – генотипы (x i ). Например так: A/A - 0, A/T - 1, T/T - 2 Нелинейные многомерные регрессии, реализованные в пакетах Statistica и SPSS Для логиcтической регрессии a i =ln(OR i ) Самое простое и необходимое: вычисление средних частот аберраций для носителей различных генотипов. Далее сравнение по непараметрическому тесту (не по Стьюденту!) Статистический анализ сопряженности частот аберраций и генотипов

Что свидетельствует о генетическом характере изменчивости индивидуальной радиочувствительности? Высокая радиочувствительность клеток при некоторых тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксия- телеангиэктазия) Изменчивость реакций тканей при радиотерапии Различная радиочувствительность хромосом у носителей различных широко распространенных генотипов Прямые доказательства: «Сначала я говорил, о чем буду говорить, затем говорю, потом буду говорить, о чем сказал» Правило английского проповедника

Chromosomal aberrations under basal conditions and after treatment with X-ray in human lymphocytes as related to the GSTM1 genotype B. Karahalil, S. Sardas, et al. Mut. Res., 515 (2002) Аберрации, индуцированные 1 Гр: GSTM1 0/0 > GSTM1 + GSTM1- «положительный» генотип: +/+ либо +/0 GSTM1- «нулевой» генотип: 0/0

Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population F. Marcona, C. Andreoli, et al. Mut. Res., 541 (2003) Генотипы Аберрации, индуцированные 2 Гр: GSTM1 0/0 < GSTM1 + Противоречия с предыдущей работой вероятно связаны с «плохой» статистикой: в обеих работах анализировали метафаз для доноров

-облучение 1 Гр in vitro Цитогенетический анализ (не менее 500 метафаз на человека) 116 здоровых добровольцев до 25 лет - курсанты Военно-технического университета (г. Балашиха) Частоты спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций у здоровых добровольцев, в зависимости от генотипов по кандидататным генам Лаборатория экологической генетики Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Выделение ДНК, ПЦР-генотипирование

Генотипировано по 7 локусам, предположительно влияющим на естественную изменчивость радиочувствительности: ЛокусПолиморфизмБелокФункция CYP1A1 A4889G (8%) Цитохромы P ая фаза детоксикации ксенобиотиков CYP2D6 G1934A (14%) GSTM1 Делеция (70%) Глутатион-S трансферазы 2-ая фаза детоксикации ксенобиотиков GSTT1 Делеция (40%) GSTP1 A313G (25%) NAT2 G590A (28%) N-ацетил- трансфераза 2 MTHFR C677T (30%) 5,10-метилен тетрагидрофолат редуктаза Превращение гомоцистеина в метионин (метилирование ДНК, синтез тиминов) …> 10% Детоксикация, репарация ДНК, регуляция оксидативного ответа и клеточного цикла Созданный банк ДНК позволяет в дальнейшем продолжить поиск генов, ассоциированных с радиочувствительностью При этом основное внимание будет уделяться высокополиморфным локусам Планируются: SOD2, MDR1, XRCC1, CCND1, COMT

Спонтанные аберрации в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (1000 метафаз для каждого из 92 доноров) Частоты спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций у здоровых добровольцев, в зависимости от генотипов по кандидататным генам Лаборатория экологической генетики Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (500 метафаз для каждого из 92 доноров)

Спонтанный уровень аберраций хромосом в зависимости от «однолокусных» генотипов: предварительные итоги Обнаружены различия по аберрациям хромосомного типа между генотипами GSTM1 Средний уровень 0,009 95% доверительный интервал По суммарному количеству спонтанных аберраций генотипы не различалсь

Распределение частот спонтанных аберраций хромосомного типа в зависимости от генотипа по локусу GSTM < 0,0010,001-0,0030,003-0,0050,005-0,007>0,007 Частота аберрации хромосомного типа Относительная частота, % 0/0 (35) + (57) Спонтанные аберрации: GSTM1 0/0 < GSTM1 + 0, ,0005 0, ,0004 При этом различие средних на грани значимости: р=0,039 по Манну-Уитни GSTM1 Доноры, «свободные» от аберраций хромосомного типа: 57% «нулевых» против 27% «положительных» (OR = 3,4; p = 0,0081 по точному критерию Фишера).

Средние частоты спонтанных аберраций хромосомного и хроматидного типа в зависимости от генотипов по локусам GSTM1-GSTT (11) +0 (19) 0+ (24) ++ (38) Генотипы по локусам GSTM1-GSTT1 Частота спонтанных аберраций Хромосомные Хроматидные Дицентрические и кольцевые хромосомы, ацентрики, атипичные моноцентрики Обмены, одиночные и изохроматидные фрагменты У двойных гомозигот по делециям частота аберраций хромосомного типа в 4,5 раза ниже, чем у остальных генотипов (р = 0,016) /0+ GSTM1 Спонтанные аберации хромосомного типа Генотипы по GSTM1 отличались частоте аберраций хромосомного типа лишь на 30% (р = 0,04). Различия по частоте хроматидных аберраций не значимы GSTM1 + GSTT1 0 GSTM1 0 GSTT1 +

Спонтанные аберрации в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (1000 метафаз для каждого из 92 доноров) Частоты спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций у здоровых добровольцев, в зависимости от генотипов по кандидататным генам Лаборатория экологической генетики Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (500 метафаз для каждого из 92 доноров)

Индуцированные аберрации ( -облучение 1Гр in vitro) в зависимости от «однолокусных» генотипов Не обнаружено различий между «однолокусными» генотипами по уровню индуцированных аберраций после облучения 1 Гр in vitro Средний уровень 0,123 95% доверительный интервал

Распределения частот аберраций, индуцированных дозой 1 Гр in vitro, для различных генотипов по локусам GSTP1, MTHFR и NAT2 Число локусов (из набора GSTP1, MTHFR и NAT2) несущих минорные аллели Все локусы (GSTP1, MTHFR и NAT2) гомозиготны по мажорному аллелю Хотя бы один из локусов GSTP1, MTHFR и NAT2 несет минорный аллель Все локусы (GSTP1, MTHFR и NAT2) несут минорные аллели Два локуса из GSTP1, MTHFR и NAT2 несут минорные аллели r=0,25; p=0,0065

(14) 1 (29) 2 (40) 3 (9) Частота спонтанных аберраций Хромосомные Хроматидные Средние частоты спонтанных аберраций хромосомного и хроматидного типа для различных генотипов по локусам GSTP1, MTHFR и NAT2 Для спонтанных аберраций тенденция роста незначима

Генетика радиочувствительности человека: сопряженность соматической мутабильности с полиморфизмом ДНК Уровень спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций в зависимости от генотипов по кандидататным генам Спонтанный уровень спонтанных TCR-мутантных лимфоцитов в зависимости от генотипов по кандидататным генам

Частоты спонтанных TCR-мутантных лимфоцитов, в зависимости от генотипов по кандидататным генам ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН Лаборатория экологической генетики Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Регистрация на проточном цитофлюориметре TCR-мутантные лимфоциты Мутации аутосомных генов, приводящие к нарушению свойств Т-клеточного рецептора на поверхности Т-лимфоцитов (не образуется комплекс с CD3-антигеном)

Частота генотипов, % A/A A/G+G/G Частота TCR-мутаций ( ) CYP1A1 Распределение частот TCR-мутантных клеток ( ) для носителей различных генотипов по локусу CYP1A1 Высокую частоту TCR-мутаций имеют носители минорного аллеля G в локусе CYP1A1 OR=20,6 ; P=0,0002 по точному критерию Фишера CYP1A1 HFE147 COMT HFE845 CYP2D6 GSTM1 GSTT1 GSTP1 NAT2 MTHFR

Распределение частоты TCR-мутантных клеток ( ) при различных генотипах для усеченного распределения Распределение частоты TCR-мутантных клеток ( ) без аномально высоких значений (более 3 ) Повышенная частота TCR-мутантных клеток характерна для гомозигот по минорным аллелям локусов HFE187, GSTM1 и MTHFR (пониженная активность соответствующих ферментов) Различия достоверны только для GSTM1

Генетика радиочувствительности человека: сопряженность соматической мутабильности с полиморфизмом ДНК Удивительно, но частоты спонтанных (in vivo) и индуцированных (in vitro) аберраций хромосом ассоциированы с различными группами генов Некоторые удивительные итоги Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью хромосом Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем цитогенетических нарушений

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 00,010,020,030,040,05 Частота спонтанных аберраций Частота индуцированных аберраций ( 1 Гр in vitro ) r=0,41; p= Корреляция частот аберраций до и после облучения (1 Гр in vitro, 97 доноров) Ранговая корреляция r=0,27; p=0,004

Эксперессия изученных полиморфных генов в тканях и лимфоцитах крови ЛокусПолиморфизмЭкспрессия Экспрессия в лимфоцитах GSTM1 11p13.3 Делеция 14 kb (70%) Печень > тестикулы > мозг > надпочечник+ GSTT1 22q11.2 Делеция 54 kb (40%) Эритроциты > легкие > почки > мозг > сердце- GSTP1 11q13 exon 5 A313G Ile 105 Val (25%) Легкие > плацента > мочевой пузырь > молочная железа + MTHFR 1p36.3 exon 4 C677T Val 114 Ala (30%) Везде?+

Генетика радиочувствительности человека: сопряженность соматической мутабильности с полиморфизмом ДНК Некоторые удивительные итоги Удивительно, но частоты спонтанных (in vivo) и индуцированных (in vitro) аберраций хромосом ассоциированы с различными группами генов Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью хромосом Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем цитогенетических нарушений

Частота аберраций у «нулевых» генотипов по отношению к частоте аберраций у носителей функционального аллеля локусов GSTM1 и GSTT1 по данным различных источников ТестВоздействие Отношение частот аберраций (0 к +) Число людей Число клеток на человека Источник GSTM1GSTT1 ХА 00, Karahalil, Гр1,28 ХА 01,170,45 * 31100Marcon, Гр0,79*0,80* СХОНекурящие0,971, Tuimala, ХАНекурящие1,420, ХАКурящие0,871, ХА00, Kocabas, МЯ00,940,55 * Kirsch-Volders, МЯ00,67*0,68*561000Iarmarcovai, 2006 ХА00,890, Catalan, ХА00,970, Rossi, 2009 ХА 00,85**1, Наши данные, Гр1,001, Спонтанные и индуцированные аберрации хромосом: случаи когда GSTM1 0/0 < GSTM1 + Частота аберраций для GST 0/0 Частота аберраций для GST + Спонтанные и индуцированные аберрации хромосом: случаи когда GSTT1 0/0 < GSTT1 + Тип воздействия. 0 – спонтанный уровень ХА – хромосомные аберрации СХО – сестринские хроматидые обмены МЯ - микроядра Статистически обусловленные исследования Повышенная устойчивость гомозигот по делециям GST скорее является правилом, чем исключением

GST 0/0 – генотип, с которым традиционно связывают: Повышенную чувствительность ко всем химическим токсикантам, особенно на фоне курения Предрасположенность ко многим распространенным системным заболеваниям (рак, астма, бесплодие, гипертония, болезнь Альцгеймера) Почему этот вывод выглядит крамолой? ~ 6000 работ о делециях GST c 1975 г. (из них 5000 об ассоциациях с раком ) Это бесспорно! Глутатион-S-трансферазы – это все-таки детотоксиканты В основном данные противоречивы. При этом прослеживается желание приписать «нулям» предрасположенность к любым недугам

High-Throughput Detection of GST Polymorphic Alleles in a Pediatric Cancer Population P. Barnette, R. Scholl, et al. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention (2004) 8 видов «детских» раков 13 генотипов OR=6,4 P=0,007 OR=2,3 P=0,018 Контроль OR1 Гомозиготность по делециям генов GST защищает детей от рака?

/0 +/0+/+ + Генотипы по GSTM1 Частоты генотипов, % Здоровые РМЖ Association of homozygous wild-type glutathione S-transferase M1 genotype with increased breast cancer risk Roodi N., Dupont W.D., Moore J.H. et al. Cancer Res. (2004) Обычная методика позволяет увидеть лишь такую картинку: эффектов нет +/+ и +/0 Выявляя гомозиготы +/+, видим ассоциацию РМЖ с функциональным аллеллем (OR=2,83; p=0,002) Методы генотипирования, позволяющие различать генотипы +/+ и +/0 (ПЦР в реальном времени, продленный режим амплификации)

Что может обеспечивать повышенную устойчивость гомозигот по делециям локусов GST ? Уменьшение активности пищевых антиоксидантов в присутствии GST (изотиацианаты являются субстратом для GSTM1) Некоторые цитаты и спекуляции: Показатели антиоксидантной защиты (активность глутатион пероксидазы, церулоплазмина и др.) выше при наличии в пуле GST одного или нескольких функционально менее активных вариантов Повышенная репарационная способность как компенсаторный эффекта дефицита GSTM1 При избытке активного GST нарушается нормальный ход апоптоза И все же должен существовать более универсальный механизм поддержания делетированного аллеля GSTM1*0 в популяции: Популяционная частота GSTM1*0 превышает 70% ! В результате каждый второй из нас (0,7 2 =0,49) не продуцирует фермент, ответственный за обезвреживание очень широкого класса генотоксикантов

Мета-анализ: частота гомозигот по делеции GSTM1 в контрольных выборках в зависимости от года публикации данных (206 работ за период гг.). Частота «нулевых» генотипов GSTM1 в контрольных выборках: слабая, но достоверная тенденция к возрастанию за 20 лет

Генетика радиочувствительности человека: сопряженность соматической мутабильности с полиморфизмом ДНК Некоторые удивительные итоги Удивительно, но частоты спонтанных (in vivo) и индуцированных (in vitro) аберраций хромосом ассоциированы с различными группами генов Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью хромосом Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем цитогенетических нарушений

Аберрации, индуцированные 1 Гр: GSTM1 0/0 = GSTM1 + (с точностью до 3-го знака) Частоты индуцированных аберраций хромосом для «однолокусных» генотипов (1 Гр in vitro) Разительных или хотя бы достоверных отличий не обнаружено! Лишь слабая корреляция с общим числом минорных аллелей в локусах GSTP1, MTHFR и NAT2 Может быть мы изучаем не те полиморфизмы?

ЛокусКодон Частота минорного аллеля Радиочувствительность генотипа Источник XPD % ХА после УФ Au, 2003 XPD % ХА после УФ разрывы ДНК Au, 2003 Naccarati, 2005 XRCC % ХА после УФ спонтанных МЯ Au, 2003 Aka, 2004 XRCC разрывы ДНК в 3 раза Jiang, 2006 XRCC % ХА после 1 Гр Au, 2003 XRCC (избыток гетерозигот) 20% ХА после 1 Гр 18% МЯ после малых доз Au, 2003 Angelini, 2004 APE (избыток гетерозигот) 15% ХА после 1 Гр Au, 2003 Высокополиморфные локусы репарации, влияющие на изменчивость радиочувствительности у человека Все приведенные эффекты на грани значимости (с поправкой Бонферрони вовсе незначимы) Похоже, это – общее правило: сильные эффекты в ассоциативных исследованиях полиморфизма ДНК никогда не воспроизводятся …и еще больше работ с отсутствием достоверных эффектов

Human genetic variation and its contribution to complex traits K. Frazer, S. Murray et al. Nature (April 2009) Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,1 1,2) Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими совершенно различными заболеваниями (признаками) Итоги 10 лет GWA-исследований GWA (Genome-Wide Association): ассоциативные исследования с использованием микрочипов. Генотипирование по > SNP

Влияние выявленных SNP трудно объяснить, прослеживая биохимические и метаболические цепочки При анализе выборок из других популяций (особенно при смене этноса) во многих случаях выявленные SNP теряют ассоциативность Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,1 1,2) Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими совершенно различными заболеваниями (признаками) Куда подевалась остальная изменчивость, и что мы ловим в исследованиях типа GWAS? Пока за счет SNP-изменчивости удается объяснить не более 30% наследуемой изменчивости количественных признаков Human genetic variation and its contribution to complex traits K. Frazer, S. Murray et al. Nature (April 2009)

Виды генетического полиморфизма SNP – Single Nucleotide Polymorphism - однонуклеотидные замены оснований в ДНК Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный. Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок. Дупликации – в популяции встречаются хромосомы с несколькими копиями одного гена STR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов (мини- и микросателлиты). Нейтральная изменчивость в некодирующей части ДНК. CNV – copy number variations (> 1 кб) CNV+инверсии – Structural Variation (SV) Делеционный полиморфизм генов GSTM1 и GSTT1 – это тоже CNV !

: открытие масштабов CNV-изменчивости Прорыв года

Как регистрируют CNV ? aCGH - array-based Comparative Genome Hybridization Хр 17 Микрочипы, с нанесенными ДНК-фрагментами ( Кб), покрывающими весь геном Тестовая и контрольная ДНК метятся разными красителямм Тестовая и контрольная ДНК конкурируют за гибридизацию с ДНК-фрагментами на микрочипе Количественный сигнал, полученный после компьютерного анализа изображений Если участок в тестовой ДНК дуплицирован, то наблюдается импульс красного цвета

Хромосомная локализация 1447 участков CNV Размер зоны CNV от 10 кб до 1 Мб в логарифмическом масштабе Частота полиморфных вариантов CNV в логарифмическом масштабе Дупликации одинаковых последовательностей Дупликации с изменением последовательности (копии совпадают на 90%)

CNV затрагивают около 3000 действующих генов и 15% из 3 Гб генома (SNP только 0,3%). Для 800 CNV полиморфизм превышает 3% За счет делеционного полиморфизма два человека могут отличаться по длине генома на 20 Мб два человека в среднем отличаются по числу копий 70 генов два человека в среднем отличаются по числу копий в 250 локусах со средним размером копии 20 кб Мы отличаемся друг от друга в большей степени структурными вариациями генома, чем нуклеотидным составом: Mб за счет CNV и лишь 2,5 Mб за счет SNP Из 3654 CNV из них 544 перекрывали действующие гены (2009) В выборке 2500 человек: 5-10% имеют CNV свыше 500 Кб и лишь 1- 2% свыше 1Мб (2009) CNV: ключевые цитаты ( 30 работ из Nature, Science, PNAS et al., ) Список полиморфных CNV с частотами и генами в зоне их влияния

Возможно CNV, а не SNP является главной причиной генетического и фенотипического разнообразия CNV регулярно и в больших количествах обнаруживаются в клетках различных раковых опухолей Устойчивость к HIV/AIDS сильно коррелирует с числом копий гена CCL3L1 (chemokine (C-C motif) ligand 3-like 1, 17q21.1) Спорадические CNV, возникающие de novo, сильно ассоциированы с аутизмом и шизофренией Делеции GST 15 лет лидируют по количеству значимых результатов в ассоциативных исследованиях У мужчин длина Y-хромосомы сильно коррелирует с предрасположенностью к криминальному образу жизни Главное отличие человека от шимпанзе на уровне генома – большое количество дупликаций

Выводы? Похоже, во многом изменчивость радиочувствительности связана с полиморфизмом структурных вариаций генома, которые вызывают изменения неспецифической устойчивости П охоже, широко распространенные SNP не вызывают существенных изменений радиочувствительности хромосом и организма в целом С этим лучше не спешить! Будем говорить о подозрениях: Похоже, существуют селективные факторы, поддерживающие полиморфизм структурной изменчивости генома на исключительно высоком уровне

Спасибо Оргкомитету школы и всем присутствующим !!! Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен