Центр изучения тромбозов и аутоиммунных заболеваний ЯГМА Ярославская государственная медицинская академия Научное общество «Клиническая гемостазиология»

Клинические проявления патологии гемостаза ТРОМБОЗЫ КРОВОТЕЧЕНИЯ ДВС Компоненты системы гемостаза Генез многих геморрагических и тромботических заболеваний может носить смешанный характер, то есть вовлекать несколько звеньев системы гемостаза Сосудистая стенка Тромбоциты Плазменные факторы коагуляции Естественные антикоагулянты Система фибринолиза Другие протеины (ф-р Виллебранда, белки острой фазы и др.) Низкомолекулярные субстанции (фосфолипиды и др.)

Тромбозы… Ежегодно 1 из 250 человек на Земле погибает от тромбозов… Атеротромбоз: 3 из 1000 живущих погибает от острой ишемии жизненно важных органов Причина более 50% смертей в индустриально развитых странах Тромбоз глубоких вен ног: 1-2 случая на 1000 человек в год Смертность 6%, через 1 год – 20% В России ежегодно венозный тромбоз развивается у 240 тыс. чел., у 100 тыс. из них - ТЭЛА У 300 человек из 100 тыс. популяции перенесенный венозный тромбоз является причиной трофических язв ног J Thromb Haemost Бокарев и соавт. «Тромбозы и противотромботическая терапия в клинической практике», 2009г.

ТЭЛА более, чем в 50% случаев ТЭЛА остается «незамеченной» только тщательное исследование легочных артерий при аутопсии позволяет диагностировать ТЭЛА и «маскировка» симптомов под другие заболевания (легкие, сердце) сложность инструментальной диагностики Причины венозного тромбоза? Факторы риска? ПРОФИЛАКТИКА !

ТРИАДА ВИРХОВА Стаз крови - ХСН - иммобилизация, гиподинамия - венозная недостаточность и др. Повреждение сосуда - атеросклероз - тромбоз в анамнезе -травма, операция, инфекция и сепсис - варикозная болезнь и др. Повышенная склонность самой крови к тромбообразованию (врожденная и/или приобретенная тромбофилия)

Факторы риска и состояния, «приводящие» к гематогенной тромбофилии или усугубляющие врожденные дефекты гемостаза Возраст старше 40 лет (>40,>60,>75) Общая анестезия Беременность, послеродовый период Полицитемия, тромбоцитозы Послеродовый периодТромбофилии Хирургические вмешательства (особенно - ортопедические) Сахарный диабет Гипотиреоз Оральные контрацептивы, ГЗТПатология печени ХСН Воспалит. процессы, инфекции Травмы, ожоги КурениеЭмоциональные стрессы Ожирение (ИМТ>25кг/м 2, ОТ>80см жен., >94см муж.) Длительная иммобилизация, гиподинамия, постельн. режим >3дн. Злокачественные опухолиКатетеризация сосудов ХимиотерапияСКВ, другие сист. заболевания Нефротический синдромЗаболевания легких

Проблема тромбофилий Тромбофилия – врожденная или приобретенная повышенная склонность самой крови пациента к тромбообразованию Некоторые виды тромбофилий или их сочетание обусловливают более длительное (даже пожизненное) и интенсивное использование антикоагулянтов

Генетические тромбофилии Фактор V Leiden (+/-, +/+) (резистентность фактора V к активированному протеину С) Мутация протромбина (+/-, +/+) Мутация в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (+/+) (предрасположенность к гипергомоцистеинемии) Мутация в гене ингибитора активатора плазминогена PAI-1 (+/+) Мутация в гене фибриногена С10034Т (+/+)

Антитромбин III, протеин C, протеин S - Дефект естественных антикоагулянтов - Резистентность фактора V к активированному протеину С - Повышение активности фактора VIII - Волчаночный антикоагулянт, антифосфолипидные антитела - АФС -Гипергомоцистеинемия -Lp(a)

Диагностика тромбофилий не является затратной, технически быстро выполнима «Пронто Тромбориск»

Чем «слабее» стимул, вызвавший тромбоз, тем больше вероятность врожденной патологии гемостаза, что крайне важно учитывать при назначении терапии и/или профилактики (характер, интенсивность, продолжительность) Во многих случаях тромбозы являются идиопатическими (возникают на фоне полного физического «благополучия», без очевидных воздействующих факторов)

Проблемы… 1) Несмотря на то, что в первичной тромбопрофилактике нуждается очень большое число пациентов, во многих случаях она не назначается… недооценка риска тромбоза боязнь кровотечения 2) Вторичная профилактика назначается на непродолжительное, то есть неадекватное риску рецидива время

Ключевые вопросы гемостазиологии факторы риска тромбоза ? когда они «проявятся» тромбозом?

Одним из вариантов контроля за пациентами с высоким риском развития и рецидива тромбоза является исследование в крови уровня маркеров активации гемостаза, маркеров тромбообразования, а также глобальных тестов оценки активности коагуляции

Приказ МЗ РФ 233 от Утвердить отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Профилактика ТЭЛА при хирургических и иных инвазивных вмешательствах Ю.Л.Шевченко «Критерий удлинения профилактики – действие факторов риска, динамика тромбинемии» «Существует подход ориентированный на прекращение профилактики только после нормализации уровня продуктов паракоагуляции в крови»

Фибриноген DDDDее Фибрин-мономер (растворимый) Фибрин-полимер (нерастворимый) Активация свертывания Тромбин Отщепление фибринопептидов А,В Спонтанно, при достаточной концентрации DDе А А В В

DDDDее Фибрин-полимер Тромбин XIII XIIIa D DD Dе е DDе DDеDDе Поперечно-сшитый фибрин D D е Плазмин + Активация фибринолиза DеD

«+» D-димера Высокая чувствительность при развитии тромбоза Доступность методов быстрого и точного выполнения количественного анализа (иммунотурбидиметрия, иммунохемилюминесценция, ИФА и др.) и экспресс- системы Может быть использован как маркер активации гемостаза, предиктор рецидива ВТЭ Диагностическая и прогностическая ценность показаны во многих исследованиях, определены допустимые уровни (нормы) Большая специфичность, чем у РФМК, ПДФибриногена

Клиническое применение D-димера Диагностика ВТЭ Исследование степени активации гемостаза в оценке риска развития ВТЭ, патологии беременности ДВС-синдром Важный критерий дифф. диагностики ДВС и патологии печени (при удлинении скрининговых тестов, тромбоцитопении) Мониторинг антикоагулянтной терапии (?: порог отсечки. 250нг/мл)

NycoCard Reader II (Axis-Shield, Норвегия) Тест основан на методе иммунометрического анализа сэндвичевого типа Продолжительность исследования 3 минуты Границы измерения нг/мл Уровень Cut-off 0.3 mg/L Позитивный контроль ~2 mg/L Тест сертифтирован Европейской референс-лабораторией Большой срок хранения реактивов Использование человеческих моноклональных антител к нео-антигену D-димера не дает перекрестных реакций к мономерам фибрина и к фибриногену

Triage ® MeterPro Иммунофлуоресцентный метод детекции Прибор считывает тест-панель и выдает количественный результат в течение 15 минут Отсутствие пробоподготовки (цельная кровь, плазма) D-димер: нг/мл; Cut-Off 400 нг/мл Доступные тесты: Myoglobin; CK-MB; Troponin-I; BNP; D-Dimer Высокая точность получаемых результатов Питание: кабельное или от батареи Наличие встроенного принтера Возможность подключения к ЛИС

Тестируемый материал: цельная кровь плазма Определяемые параметры: Тропонин I Nt-proBNP D-димер Рабочий диапазон «D-димер»: нг/мл DXpress ридер

«-» D-димера Зависимость не только от активации коагуляции, но и от интенсивности фибринолиза (при гипофибринолизе уровень D-димера не будет отражать реальной активности гемостаза) Связь с активностью воспалительного процесса Снижение специфичности у пожилых пациентов Может повышаться при кровотечениях

Уровень D-димера свидетельствует об уже протекающем процессе фибринообразования (источник – только фибрин) и фибринолиза, но не говорит о тромбогенном потенциале Palaretti et al. NEJM 2006; 355: 1780 Глобальный тест оценки активности системы свертывания, ее тромбогенного потенциала Тест генерации тромбина (TGA)

Тромбин – ключевая молекула гемостаза активация процесса перехода фибриногена в фибрин активация ф.V, VIII, XI, XIII активация PAR-рецепторов тромбоцитов активация тромбомодулина (система прот.С, S) активация TAFI (участие в фибринолизе) участие в процессе воспаления и др. Тест генерации тромбина (TGA) – результат комплекса взаимодействий различных систем гемостаза

Тромбоз Время Тромбин норма кровотечение Тест генерации тромбина Hemker et al.

Принцип теста: каскад коагуляции активируется добавлением к плазме различных концентраций тканевого фактора и фосфолипидов. Генерируемый в процессе активации коагуляции тромбин расщепляет флюорогенный субстрат и производится детекция изменений его флюоресценции РеагентСостав RAМало ФЛ и нет ТФ RBМало ФЛ и мало ТФ (в буфере) RC LowМало ФЛ и много ТФ RC HighМного ФЛ и много ТФ RDСпец. «композиция» ФЛ

РеагентЦель исследования TGA RA Активность микрочастиц TGA RВ и TGA RC Low - Контроль степени «манифестации» тромбофилии -Контроль геморрагических нарушений -Тромбогенность микрочастиц -Ф.VII, Xa, XIa TGA RC High Мониторинг антикоагулянтной терапии TGA RD -Мониторинг гепаринов, новых антикоагулянтов (ингибиторов Ха и IIa) -Активность ф.XII, калликреина Реагент Состав RAМало ФЛ и нет ТФ RBМало ФЛ и мало ТФ (в буфере) RC Low Мало ФЛ и много ТФ RC High Много ФЛ и много ТФ RDСпец. «композиция» ФЛ

Какие функции осуществляет активный тромбин Однако, по выходу фибрина нельзя судить о повышенном тромбогенном потенциале системы свертывания, т.к лишь часть активности тромбина идет на образование сгустка.

Диагностическую значимость имеет не только величина пика активности тромбина, но и фаза ожидания, угол наклона образования тромбина – в целом профиль кинетической кривой, как уникальная характеристика исследуемой плазмы

Ход определения: 60минут с измерением каждую минуту (60 точек) Определяемые параметры: - пиковый (максимальный) уровень тромбина (nM) - время достижения пика - динамика образования (Slope) в минуту - Lag-фаза (от момента добавления реагента до начала образования тромбина) - площадь под кривой -Скорость образования (velocity index) = = Пиковый уровень / (Пиковое время – Lag-фаза) Пик и Скорость зависят от концентрации фосфолипидов в образце. Так как в реагентах количество их лимитировано, то указанные показатели будут зависеть от количества микрочастиц в образце. Оба параметра отражают также амплификацию «предсуществующего» тромбина (т.е. при значимой тромбофилии) и снижены при антикоагулянтной терапии и геморрагических заболеваниях.

Тест генерации тромбина ОСНОВНОЕ ПРЕИМУЩЕСТВО перед тестом ЕТР (эндогенный потенциал тромбина) повышен при любой гиперкоагуляции понижен при любой гипокоагуляции ГДЕ БУДЕТ ПОЛЕЗЕН: -контроль за всеми группами антикоагулянтов, в т.ч. новыми -контроль «реализации» тромбофилий (врожденных и приобретенных), в т.ч. в педиатрии - ДВС -контроль активности гемостаза при беременности, у пациентов с ИБС, перенесенным ОНМК и др. -гемофилия и др. гипокоагуляционные состояния (врожденные и приобретенные), контроль заместительной терапии -научные цели (активность микрочастиц (отдельный реагент) и др.)

Влияние различных факторов: Воспаление (травма, хирургия, инфекция и др.), кровотечение, гематома, инфаркт, опухоль, беременность, эстрогены (D-димер)(TGA)

CEVERON-ALPHA – универсальный автоматический анализатор ОТКРЫТОГО типа CEVERON-ALPHA для 4 методов анализа: - коагулометрия АЧТВ, ПВ, ТВ, Фибриноген, Протеин С, ВА, дефицит факторов свертывания, мутация Лейдена и другие. - фотометрия С1-ингибитор, FVIII, Протеин С, АТ-III и другие. - турбидиметрия D-димер, ВА, С-реактивный белок и другие. - флуориметрия кинетика образования эндогенного тромбина (для модификации Ceveron TGA) Автомат CEVERON-ALPHA TGA позволяет проводить уникальный флуориметрический TGA- анализ 360/430 нм Длины волн фотометрического блока: 405, 570, 630 и 740 нм Скорость проведения анализов на CEVERON-ALPHA до 70 образцов/час (ПВ) (Стационар на больных)

Маркеры активации системы тромбообразования (постоянного внутрисосудистого микросвертывания крови) Маркеры тромбинемии: Комплекс Тромбин-Антитромбин III (TAT) Фрагмент протромбина (F1+2) Маркеры фибринообразования: Фибринопептид А D-димер Поздние маркеры активации (маркеры реактивного фибринолиза) D-димер Комплекс плазмин-антиплазмин (PAP) (0-514нг/мл)

Комплекс Тромбин-Антитромбин (ИФА) Клиренс тромбин-антитромбинового комплекса из системы циркуляции достаточно быстрый, он удаляется в течение нескольких минут. Присутствие ТАТ в плазме свидетельствует об образовании тромбина in vivo непосредственно в момент взятия крови на исследование и о возможности истощения антикоагулянтов. Определение ТАТ очень информативно в острой ситуации, непосредственно при тромбообразовании с целью диагностики состояния гиперкоагуляции, которое может быть значимым при тромботических состояниях и последующей тромболитической терапии. Определение ТАТ характеризуется высокой аналитической чувствительностью, поэтому его увеличение можно зарегистрировать до появления клинических признаков ДВС- синдрома. Норма ТАТ – 2,1+1,3 нг/мл

Фибринопептид А (ИФА) Образуется при ферментативном действии тромбина в результате отщепления от N-конца Aα-цепи фибриногена. Повышенный уровень фибринопептида А в крови говорит о гиперактивности тромбина и наряду с D-димером является маркером ДВС-синдрома и риска развития тромбозов. Однако полная корреляция с уровнем Д-димера не обязательна, поскольку фибринопептид А образуется на стадии формирования фибринового сгустка, а Д-димер генерируется при его лизисе. Норма – менее 3 нг/мл

Маркеры активации системы тромбообразования (постоянного внутрисосудистого микросвертывания крови) Активация каскада коагуляции: тканевый фактор и его активность (ДВС, онкология, кардиология, неврология и др. области) TFPI / Xa – комплекс активность отдельных факторов свертывания Фибринолиз: t-PA (антиген и активность) PAI-1, PAI-1/Upa, t-PA/PAI u-PA (антиген и активность) TAFI

Важнейшая проблема гемостазиологии – оценка реальной активности фибринолиза, а не только реактивных изменений на фоне активации гемостаза и тромбоза. Гипофибринолиз может служить важнейшей причиной локальных нарушений микроциркуляции (акушерская патология и др.) Тромбоэластометрия «видит» фибринолиз как есть? Мнения противоречивы Hyperfibrinolysis Normal Thrombocytopenia Hypercoagulation Гиперфибринолиз Норма Тромбоцитопения Гиперкоагуляция

Важнейшая проблема гемостазиологии – оценка реальной активности фибринолиза, а не только реактивных изменений на фоне активации гемостаза и тромбоза. Только комплексный анализ активности плазминогена, его активаторов (t-PA) и ингибиторов (PAI-1 и др.) может дать реальное представление об активности системы фибринолиза Фибринолиз: t-PA (антиген и активность) PAI-1, PAI-1/Upa, t-PA/PAI u-PA (антиген и активность) TAFI

Маркеры активации системы тромбообразования (постоянного внутрисосудистого микросвертывания крови) Для более дифференцированной трактовки результатов рекомендуется одновременное определение показателей активности воспаления (С-реактивный белок, фибриноген, ИЛ6, sCD40 и др.)

Маркеры активации тромбоцитов ИФА: - GPIIb/IIIa - PF4, тромбомодулин - sP-селектин, sGPV и другие Флоуцитометрия тромбоцитов: - уровень экспресси тромбоцитарных рецепторов CD41(GPIIb), CD42 (GPIb), CD61(GPIIIa), CD62P(P-селектин), CD63(гранулофизин) - определение и фенотипирование эндотелиальный, тромбоцитарных и лейкоцитарных микрочастиц Агрегатометрия тромбоцитов с различными концентр. индуктора (АДФ) ?

Резистентность к антиагрегантам Методы определения: - время кровотечения - оптическая или импедансная агрегатометрия - Ultegra Rapid Platelet Function Assay - Тромбоэластография - Проточная цитометрия (экспрессия GPIIb/IIIa, P-селектина, VASP) - Тромбоксан В2 в плазме, 11-дегидротромбоксан В2 в моче и др. (VerifyNow® и др.)

НеэффективностьНормальный ответ

Маркеры активации/повреждения эндотелия ИФА: - эндотелин - молекулы адгезии (ECAM, sVCAM-1 и др.) - EPCR - PF4, тромбомодулин - фактор Виллебранда и другие Флоуцитометрия : - микрочастицы, эндотелиоциты, экспрессия тканевого фактора

Активация тромбоцитарного звена гемостаза одновременно с коагуляционным может служить показанием для комбинированной антикоагулянтной и антиагрегантной терапии Также маркеры активации тромбоцитов могут служить критерием эффективности использования антиагрегантов (АСК, Клопидогрел)

Маркеры активации : трудности определения -формат ИФА трудоемок; -сложность преаналитического этапа (необходимость быстрого выполнения исследования, холодовых условий, включая центрифугирование, сложности транспортировки и др.); -некоторые показатели не стандартизованы; -короткий период присутствия в плазме (минуты);

Клиническая оценка риска тромбоза, диагностика тромбофилий, проведение глобального коагуляционного теста (теста генерации тромбина) и определение маркеров активации гемостаза дополняют друг друга, а не взаимозаменяют Повышение уровня маркера активации – это сигнал уже развивающегося неблагополучия в свертывающей системе, то есть можно не успеть предотвратить катастрофу

Средства «последней надежды»: Макроуровень – УЗИ сосудов, коронарография и т.д. «Микроуровень» – маркеры активации гемостаза

С другой стороны, маркеры активации гемостаза могут быть единственным признаком «надвигающегося» тромбоза, средством объективизации риска его рецидива, признаком участия системы гемостаза в патологическом процессе (просты в понимании, информативны в динамике) Пациент С., 22 года (2004г.). Выявлена лишь гетерозиг. мутация в гене ф.V Лейден Рецидив тромбоза в 2009г…

Благодарю за внимание!