РАМН (27 сентября 2011г.) Клинические лабораторные исследования тканевых маркеров в опухолях костей Н.Е.Кушлинский И.В.Булычева Ю.Н.Соловьев Е.А.Тен И.В.Казачок Е.Ю.Руссо А.Н.Махсон

« Биологические маркеры – это количественно определяемые биологические параметры, которые как индикаторы определяют норму, патологию и результат лекарственного лечения» (Biomarkers Difinitions Working Group, USA)

На протяжении всего ХХ века исследователи пытались сформулировать конкретные признаки, которые отличают опухолевые клетки и ткани от их нормальных предшественников, поскольку прогресс в данной области представляет основу для: диагностика опухолей обнаружение рецидива выявление мишеней «таргетной терапии» оценка функционального состояния органов и систем диагностика кардио-, гепато-, нефро-, нейротоксичности оценка прогноза

Однако, по мнению основоположников молекулярной онкологии профессоров D.Hanagan и R.Weinberg, «это занятие оказалось довольно затруднительным и связано с огромным разнообразием биологических проявлений новообразований». Но, тем не менее, к настоящему времени удалось выделить и классифицировать несколько тенденций, подкрепленных данными биохимических и молекулярно-биологических исследований. (Cell Vol.100.-p.57-70).

Устойчивость к апоптозу Дерегуляция энергетических процессов Постоянные сигналы пролиферации Мутации и генетическая нестабильность Индукция ангиогенеза Активация инвазии и метастазирования Воспаление, стимулирующее опухоль Включение репликативного бессмертия Избегание имунного ответа Устойчивость к ингибиторам роста

Новообразования костей составляют от 1 до 2% всех новообразований человека. В России по данным на 2010 г. саркомы костей составили около 1% в структуре всех злокачественных опухолей. Остеосаркома составляет около 50% всех злокачественных опухолей костей. Локализация опухолевого процесса при остеосаркоме в зонах роста длинных трубчатых костей. Остеосаркома обнаруживается в лет, в 2 раза чаще выявляется у мужчин. В 95% остеосаркома метастазирует в легкие.

Болезнь всегда ведёт к смерти. Мировая литература содержит лишь немногочисленные безупречно доказанные случаи длительного излечения больных остеогенной саркомой. Если больной с диагнозом остеогенная саркома выздоровел, скорее всего следует подумать не была ли допущена диагностическая ошибка Профессор С.А.Рейнберг (60-е годы ХХ столетия)

Clinical Practice Guidelines in Oncology (National Comprehensive Cancer Network) В диагностике опухоли кости в консилиуме участвуют нескольких специалистов: ОНКОЛОГ (хирург) ПАТОЛОГОАНАТОМ РЕНТГЕНОЛОГ ХИМИОТЕРАПЕВТ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПЕВТ КЛИНИЧЕСКИЙ БИОХИМИК ГЕНЕТИК

Обследованные группы больных новообразованиями костей Нозологический вариант опухоли Число больных ПолВозрастные группы (годы)Средний возраст МужскойЖенский и >(годы) Остеосаркома ,0 0,6 Хондросаркома ,5 3,8 Саркома Юинга ,1 0,5 Злокачественная фиброзная гистоицитома ,0 2,3 Гигантоклеточная опухоль кости ,0 2,4 Всего:

ГСПС, свободный Те и ИСА в крови подростков мужского пола пубертатного периода, больных остеосаркомой и в контроле ГСПС нМ/л ИСА Остеосаркома Контроль Свободный Те %

Полипептидные гормоны у больных остеосаркомой женщин в разные периоды менструального цикла Фаза менструального цикла ГР (нг/мл) ЛГ (Ед/л) ФСГ (Ед/л) Пролактин (нг/мл) Фолликулярная Остеосаркома 4,8 1,64,3 1,85,0 0,610,5 4,0 Контроль 2,7 1,36,8 1,36,4 1,510,4 3,2 Лютеиновая Остеосаркома 4,1 0,74,0 0,83,8 0,721,5 3,7 Контроль 2,9 0,55,2 1,24,3 0,68,6 4,0

Опухоли Рецепторы обнаружены (%) РЭРА Молочная железа 7934 Матка 6955 Яичники 7750 Влагалище 56 Гортань 6952 Простата 5877 Желудок 4830 Прямая кишка 31 Печень 4073 Поджелудочная железа 0100 Легкие 160 Почки 5100 Меланома 258 САРКОМЫ КОСТЕЙ Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека

Месяцы Выживаемость, % Рецепторы андрогенов в прогнозе общей выживаемости больных остеосаркомой P*vs**

Рецепторы эстрогенов и общая выживаемость больных остеосаркомой в условиях адъювантной терапии Время (месяцы) Выживаемость (%) P*vs**

Метаболизм андрогенов в тканях-мишенях Эстрогены Андрост-4-ен-3,17-дион 5 -андростан-3,17-дион Андростерон Изо-андростерон Тестостерон Дигидротестостерон 5 -андростан-3,17 -диол Триолы ,7 Ферменты: редуктаза 3 - ароматаза Гидроксистероидоксидоредуктазы: ; ; ; ; , 7 -

Тестостерон Дигидротестостерон 5 -редуктаза 3 -диол 3 -гидроксилаза Метаболизм андрогенов в опухолях костей Активности ферментов в опухолях 5 -редуктаза 3 -гидроксилаза ХОНДРОСАРКОМА Гигантоклеточная опухоль Остеосаркома Саркома Юинга САРКОМА ЮИНГА Гигантоклеточная опухоль Хондросаркома Остеосаркома САРКОМА ЮИНГА Гигантоклеточная опухоль Хондросаркома Остеосаркома Х (обнаружено впервые)

VEGF-B167 VEGF-B186 PLGF-1,2 VEGF-A121 VEGF-A145 VEGF-A165 VEGF-A206 VEGF-A189 VEGF-EVEGF-C VEGF-D VEGFR-1 VEGFR-2 VEGFR-3 PI3-K Akt/PKBp38MAPK Raf MEKERK Проницаемость сосудов Выживание эндотелиальных клеток Миграция эндотелиальных клеток Пролиферация эндотелиальных клеток Система VEGF

Активаторы ангиогенеза Ингибиторы ангиогенеза Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) Эндостатин Плацентарный фактор роста (PlGF) Ангиостатин Факторы роста фибробластов (FGF) 16 кДа фрагмент пролактина Трансформирующие факторы роста и Трансформирующие факторы роста и Ламинин Эпидермальный фактор роста (EGF) Фибронектин Инсулиноподобные факторы роста (IGF) Тромбоспондин Тромбоцитарный фактор роста эндотелиоцитов (PDECGF) Тромбоцитарный фактор-4 (PF-4) Фактор некроза опухолей (TNF, низкие дозы) Фактор некроза опухолей (TNF, высокие дозы) Интерлейкины (IL-1, IL-3, IL-6, IL-8) Интерлейкины (IL-12) Колониестимулирующие факторы Интерфероны Ангиогенин (Ang) Ингибиторы тканевых металлопротеиназ Активатор плазминогена урокиназного типа (uPA) Ингибиторы активаторов плазминогена (PAI-1, PAI-2)

Содержание VEGF в опухолях Тип опухолиЭкспрессия VEGF (%) Рак молочной железы58 Рак толстой кишки55 Немелкоклеточный рак легкого52 Рак яичников65 Саркома мягких тканей40 Хондросаркома90 Остеосаркома56 Рак почки60 Гиперэкспрессия VEGF в опухоли коррелирует с плохим прогнозом

Ингибиторы ангиогенеза, направленные на подавление активности проангиогенных факторов ПрепаратМеханизм эффекта Бевацизумаб (Авастин)Рекомбинантные человеческие моноклональные антитела к VEGF. Сорафениб (Нексавар) Мультитаргетный тирозин-киназный ингибитор. Подавляет активность: PDGFR-B – рецептор тромбоцитарного фактора роста В; VEGFR-2 и VEGFR-3; RAF-1 – ключевой фермент сигнального пути RAS-RAF-MEK-ERK; c-KIT – трансмембранный тирозинкиназный рецептор фактора роста; Ген ret. Сунитиниб (Сутент) Мультитаргетный тирозин-киназный ингибитор. Подавляет активность: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3; PDGFR-A, PDGFR-B; c-KIT; Ген ret.

Схема биосинтеза простагландинов и лейкотриенов Арахидоновая кислота Лейкотриены ПГН 2 ПГF 2 ПГЕ 2 Простациклин 6-кето-ПГF TxA 2 TxB 2 Липоксигеназа Тромбоксан-синтаза ПГ-оксоциклаза Фосфолипиды (мембрана) Фосфолипаза А 2 ПГЕ-изомераза ПГ-редуктаза Циклооксигеназа

Содержание ПГЕ 2 в остеосаркоме и доброкачественных опухолях кости ОстеосаркомаДоброкачественные опухоли Концентрация ПГЕ 2 (пг/г ткани) Метастазирование остеосаркомы и ПГЕ 2 в опухоли Выживаемость, % Метастазирование остеосаркомы в 1-й год наблюдения у пациентов, леченных адриамицином перед операцией, и уровни ПГЕ 2 Метастазы в легких обнаружены, % Месяцы

Сигналы активирующие p53 и его эффекты Недостаточность нуклеотидов Ультрафиолетовое излучение Ионизирующее излучение Онкогенные сигналы Гипоксия Блокирование транскрипции p53 Остановка клеточного цикла Восстановление ДНК Блокирование ангиогенеза Апоптоз Физиологическое старение клетки Возврат к пролиферации или

р53 в опухоли и выживаемость больных остеосаркомой р=0,04 р=0,1 Медианы 49,4 мес. 18,3 мес.. Медианы 24,5 мес. 10,8 мес.

Про-апоптотические сигналы опосредованные Bcl-2 белками Выживание клетки Про-апоптотический эффект Bcl-2 Bcl-X L Bcl-w Mcl-1 A1 BaxBak АПОПТОЗ Bim Puma tBid Noxa

Ваx в опухоли больных хондросаркомой Доброкачественные хрящеобразующие опухоли Хондросаркома р=0,0001 Частота выявления Степень злокачественности опухоли Критерий распространенности Т р=0,05 р=0,2 Среднее значение Частота выявления

Безрецидивная выживаемость больных хондросаркомой с учетом выявления Вах в опухоли p=0,01

SRCCBLPLCPI3KSHP2 GAP P21-GDP P21-GTP SOS NCKVAVGRB-7CRKJAC GRB-2 SHC AKT BADS6KPKC RAF MEK MAPK RAC PAK JNKK JNK ABL SP1MYCFOS JUN ELKERG1STAT HER1 HER2 HER3 HER4 LPA тромбин TGF-αEGFЭпирегулинΒ-целлюлинHB-EGF Амфи- регулин NRG-1NRG-2NRG-3NRG-4Цитокины АПОПТОЗ МИГРАЦИЯ РОСТ АДГЕЗИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ

(фмоль/мг белка) Уровни РЭФР в опухолях костей РЭФР+ опухоли (%) Частота выявления РЭФР в опухолях костей Безрецидивная выживаемость больных остеосаркомой с учетом уровня РЭФР в опухоли P*vs**>0.05 P*vs***

Частота выявления ЭФР-подобных пептидов в остеосаркоме Общая выживаемость больных остеосаркомой с учетом наличия ЭФР-подобных пептидов в опухоли Время (дни) Выживаемость (%) P*vs**

Выявление Her-2/neu в опухоли и выживаемость больных остеосаркомой р=0,01 р=0,03 Медианы 31,3 мес. 8,7 мес. Медианы 49,3 мес. 21,7 мес.

Препараты, влияющие на ЭФР-зависимые процессы в опухолевых клетках

ИнсулинIGF-IIGF-II αα β β αα β β αα β β IR-A (инсулиновый рецептор) Гибридный рецептор IGF-IIR IGF-IR IGFBP-6IGFBP-5IGFBP-4IGFBP-3IGFBP-2IGFBP-1 PAPP-APAPP-A2 MMP-1 MMP-2MMP-3 Кальций-зависимая сериновая протеаза ПлазминТромбин PSA Сериновая протеаза Цистеиновая протеаза Катепсин-L Лиганды Рецепторы Протеазы IGFBP Система IGF

Направление терапии Применяемые препаратыИсследования IGF-I и IGF-II Препараты уменьшающие биодоступность лигандов: Аналоги саматостатина Антагонисты гормона роста (GH) Рекомбинантные человеческие IGFBP Эффект в преклинических исследованиях остеосаркомы. Клинические исследования, фаза I – значимого эффекта не получено IGF-IR Антитела к IGF-IR – R-1507 Клинические исследования, фаза I – эффект у 4 из 8 больных саркомой Юинга Антитела к IGF-IR – AMG-479 Клинические исследования, фаза I – эффект при лечении саркомы Юинга Моноклональные антитела CP-751, 871 Клинические исследования, фаза I – частичный эффект при лечении саркомы Юинга R1501, AMG479, CP-751, 871 Клинические исследования, фаза II – проводятся в настоящее время Тирозинкиназный домен IGF-IR Ингибиторы тирозинкиназного домена: NVP-AEW-541 и NVP-ADW-742 Преклинические модели сарком скелетной мускулатуры Bart Rikhof et al., 2009

Частота выявления ММР-1 в хондросаркомах Доброкачественные хрящеобразующие опухоли Хондросаркома p

ММР-1 в хондросаркомах частота Содержание в % р=0,4 Степень злокачественности опухоли р=0,18 р=0,16 Критерий распространенности Т частота Содержание в % р=0,027

Общая и безрецидивная выживаемость больных хондросаркомой с учетом выявления ММР-1 в опухоли р=0,03р=0,049 Многофакторный анализ общей и безрецидивной выживаемости выявил, что на отдаленные результаты лечения больных хондросаркомой влияют критерии Т и G, а также показатель ММР-1 в опухоли. У больных хондросаркомой G1-G2 степенями злокачественности наличие в опухоли ММР-1 снижало 3-летнюю безрецидивную выживаемость на 40%. Определение ММР-1 в ткани опухоли больных хондросаркомой может являться только дополнительным прогностическим фактором заболевания.

Общая и безрецидивная выживаемость больных хондросаркомой с учетом содержания ММР-9 в опухоли р=0,2р=0,007 У больных хондросаркомой кости с распространенностью Т2-Т3 и содержанием в опухоли ММР-9 более 40% снижало 3-летнюю безрецидивную выживаемость на 30%. Определение ММР-9 в хондросаркомах может служить дополнительным прогностическим фактором.

Сравнение содержания t-PA, u-PA и PAI-1 в метастазирующих и неметастазирующих остеосаркомах

Сравнение содержания t-PA, u-PA и PAI-1 в рецидивных и безрецидивных хондросаркомах

Молекулярно-биологический «портрет остеосаркомы» (тканевые маркеры)

Показатели 5-летней безметастатической выживаемости больных остеосаркомой после комплексного лечения Время после хирургического лечения (годы) Больные без метастазов, % 7,0 48,2 72,3

Основные свойства опухолевых клеток Hanahan and Weinberg, 2011 (Cell 144, 4 March 2011) Дерегуляция энергетических процессов Устойчивость к апоптозу Постоянные сигналы пролиферации Мутации и генетическая нестабильность Индукция ангиогенеза Активация инвазии и метастазирования Воспаление, стимулирующее опухоль Включение репликативного бессмертия Избегание имунного ответа Устойчивость к ингибиторам роста Ингибиторы PARP Ингибиторы EGFR Ингибиторы теломераз Ингибиторы VEGF Ингибиторы HGF\Met Аэробные ингибиторы гликолиза Ингибиторы циклин-зависимых киназ Иммунологическая активация CTLA4mAT Селективные противо- воспалительные препараты Проапоптатические ВН3 миметики