Иванова Анна Пустоварова Мария Научные руководители: д.б.н. В.В.Алёшин К.В.Михайлов Москва, 2011 Московская гимназия на Юго-Западе 1543 Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Лаборатория геносистематики

Введение На сегодняшний день систематику эукариот нельзя считать сложившейся. Наиболее распространена классификация Кавалье-Смита, согласно которой все эукариоты делятся на одножгутиковых и двужгутиковых. Изучаемый нами объект принадлежит кладе Heterokonta (разножгутиковые) (рис.1)

Рисунок 1. Филогенетическое положение клады Heterokonta.

Введение Объект нашего изучения- представитель ещё не описанного вида. Его наиболее близкий родственник- Developayella elegans (см рис.) D. elegans- одноклеточный организм, питающийся бактериями и передвигающийся с помощью одного из своих жгутиков. (рис.2) Возможно, D. Elegans - близкий родственник оомицетов. Рисунок 2. Developayella elegans

Цель работы Целью нашей работы было более точное определение филогенетического положения Colp-4a. Для этого необходимо было определить нуклеотидную последовательность некоторых генов и сравнить их с соответствующими генами других гетероконт. В нашей работе проанализированы последовательности 18S и 28S рРНК нашего объекта. Несколько генов берутся для более достоверного определения филогенетического положения.

Материалы и методы Для получения необходимого участка ДНК в ходе нашей работы были использованы следующие методы молекулярной биологии: Выделение из организма тотальной ДНК Амплификация нужного фрагмента методом ПЦР Электрофорез для выявления результатов ПЦР Отделение требуемых фрагментов ДНК от побочных продуктов ПЦР Молекулярное клонирование Выделение плазмид, содержащих разные типы вставок Секвенирование

Материалы и методы Выделение культуры Colp-4a Данная культура была выделена из морского осадка, привезённого с Красного моря. Выделение геномной ДНК Для изучения данного объекта было необходимо выделить его ДНК. Этапы выделения ДНК: 1. Лизис клеток и денатурация белков 2. Удаление мембран и клеточных органелл 3. Экстрагирование ДНК из раствора

Материалы и методы ПЦР (полимеразная цепная реакция) Данный метод позволяет многократно увеличить число определённых фрагментов ДНК в пробе. Необходимые компоненты реакции: 1. ДНК-матрица 2. Прямые и обратные праймеры 3. ДНК-полимераза 4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) 5. Буферный раствор Ход реакции: 1. Денатурация (цепи ДНК расходятся) 2. Отжиг (связывание праймеров с одноцепочечной ДНК) 3. Элонгация (репликация матричной цепи ДНК-полимеразой)

Материалы и методы Г ель-электрофорез Данный метод демонстрирует концентрацию молекул ДНК в анализируемом образце, а также их длины. Элюция ДНК Данный метод используется для выделения нужной ДНК из полоски геля. Ход реакции: 1. Растапливание полоски геля и помещение её в пробирку с фильтром 2. Осаждение ДНК на фильтре, удаление остальных веществ из раствора 3. Отсоединение ДНК от фильтра

Материалы и методы Молекулярное клонирование Мы использовали данный метод для выявления и разделения разных типов фрагментов ДНК одинаковой длины, полученных в ходе ПЦР и последующей элюции. Ход работы: 1. Выделение нужного фрагмента ДНК 2. Встраивание нужного гена в вектор (плазмиду, которая разрезается рестриктазой, а к липким концам присоединяется нужная нам последовательность) (рис.3)

Рисунок 3. Плазмидный вектор Материалы и методы

3. Трансформация (введение плазмидного вектора в бактериальную клетку) 4. Отбор клеток, в которые вошла чужеродная ДНК (не все бактерии трансформируются; не все плазмиды несут вставку). Используются плазмиды, обладающие двумя свойствами: Устойчивость к ампициллину, который содержится в среде (рис.3) Вставка инактивирует ген фермента LacZ в плазмиде => колонии не окрашиваются в синий цвет. 5. Анализ колоний (случайный выбор колоний и амплификация их плазмид) (рис.4)

Рисунок 4. Анализ колоний (на рисунке – амплифицированные вставки).

Материалы и методы 6. Рестрикция вставок (различаются ли вставки по нуклеотидной последовательности?) (рис.5) Рисунок 5. Пример рестрикции. Стрелочками отмечены разные типы вставок. Молекулярное клонирование

Материалы и методы Выделение плазмид Выделение плазмид, несущих интересующую нас вставку, и их секвенирование для определения нужной вставки. Построение филогенетического дерева Сравнение полученной нами последовательности с уже секвенированными генами других гетероконт для создания выравнивания. На основе выравниваний генов 18S и 28S рРНК были построены филогенетические деревья.

Результаты В ходе работы нами были выделены и секвенированы гены 18S и 28S рРНК Были составлены три выравнивания (первое содержало лишь 18S рРНК, второе – 28S рРНК, третье - и то, и другое) На основе каждого из них построены деревья Подтвердилось, что ближайшим родственником Colp-4a является Developayella elegans. Филогенетическое дерево 18S рРНК демонстрирует родство D. elegans и оомицетов. Но, судя по дереву, построенному на основе выравнивания 28S рРНК, ни D.elegans, ни Colp-4a не входят в состав Pseudofungi. (Pseudofungi = оомицеты + близкие к ним виды)

Результаты ВНЕШНЯЯ ГРУППА Сolp-4a + D. elegans ООМИЦЕТЫ АВТОТРОФНЫЕ HETEROKONTA А) Дерево на основе выравнивания гена 18S рРНК

Результаты ВНЕШНЯЯ ГРУППА Сolp-4a + D. elegans ООМИЦЕТЫ АВТОТРОФНЫЕ HETEROKONTA Б) Дерево на основе выравнивания гена 28S рРНК

Обсуждение Подтверждено родство Colp-4a и Developayella elegans. Следовательно, их признаки должны быть схожими. Однако длина ветвей после их общего узла показывает, что уже должны были появиться различия между этими организмами. Принадлежность таксона, содержащего D. Elegans, к Pseudofungi требует дополнительной проверки. Определение филогении Colp-4a и Developayella elegans позволит уточнить признаки, характерные для группы Pseudofungi.

Выводы За время работы мы освоили многие методы молекулярной биологии. Были выделены и секвенированы гены 18S и 28S рРНК простейшего Colp-4a. Оба филогенетических дерева, построенных на основе полученных последовательностей, показывают, что Colp-4a и Developayella elegans - близкородственные виды. Филогенетическое дерево по гену 18S рРНК даёт высокую поддержку монофилии группы Pseudofungi, в то время как в дереве по гену 28S рРНК Colp-4a и Developayella elegans не входят в их состав.

Благодарности Мы благодарим: Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики. Сотрудников отдела эволюционной биохимии НИИ имени А.Н.Белозерского, которые руководили нашей работой и помогали нам её выполнять. Вахрушеву Ольгу рецензирование нашей работы.

Спасибо за внимание!

Q5d6 r71 28d528d1 28r228r1228r7 Q39 28r3 Карта ДНК в районе 18S и 28S рРНК. Фрагменты слева направо: 18S рРНК, 5S рРНК, 28S рРНК. Стрелочками обозначены различные праймеры к данным генам; сверху прямые, внизу обратные. d71 18S 28s

Используемые праймеры Ген Прай -мер Ориен- тация ПоследовательностьДиапазон устойчивости (Тпл) 18sQ51 прямойGTATCTTGTTGATCCTGCCAGTAG °C 18sQ39 обратныйGAATGATCCWTCYGCAGGTTCACCT AC °C 28s28s d1 прямойGACCCGCTGAAYTTAAGCATAT °C 28s28s d5 прямойTCCGCTAAGGAGTGTGTAACAAC °C 28s28s r7 обратныйAGCCAATCCTTWTCCCGAAGTTAC °C 28s28s r12 обратныйTTCTGACTTAGAGGCGTTCAG °C 28s28s r13 обратныйMRGGCTKAATCTCARYRGATCG °C

Рисунок 6. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 18S рРНК

Рисунок 7. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 28S рРНК

Рисунок 8. Филогенетическое дерево на основе выравнивания, содержащего гены 18S и 28S рРНК.

Литература [1] Ingvild Riisberga, Russell J.S. Orrb, Ragnhild Klugeb, Kamran Shalchian-Tabrizid, Holly A. Bowerse, Vishwanath Patilb, Bente Edvardsena and Kjetill S. Jakobsen. Seven Gene Phylogeny of Heterokonts. // Protist, Vol.160, , May [2] Mayumi Moriya, Takeshi Nakayama, Isao Inouye. Ultrastructure and 18S rDNA Sequence Analysis of Wobblia lunata gen. et sp. nov., a New Heterotrophic Flagellate (Stramenopiles, Incertae Sedis). // Protist, Vol. 151, 41–55, May [3] Neil A. Campbell, Jane B. Reece. Biology - 8th ed. Pearson Benjamin Cummings, San Francisco, [4] Cavalier-Smith T. Only six kingdoms of life. Proc R Soc Lond B. 2004;271:1251–1262 [5] Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. // Москва, изд. Мир, [6] Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, с. [7] Encyclopedia of life. Description of Developayella elegans. Режим доступа: