Микрофлора мочеполового тракта Результаты исследования вагинального биоценоза в практике врача - дерматовенеролога И.Г. Афанасьева кафедра дерматовенерологии ФПК И ППС Иркутский государственный медицинский университет, г. Иркутс к Конференция

ПЦР - это ДНК-Технология31 июля 2013 г. Введение До недавнего времени существовали значительные ограничения в изучении микробиологических сообществ. Главные из них: недостаточная дискриминация микроорганизмов по морфологическим признакам; cложности в культивировании большинства микроорганизмов. Внедрение молекулярно-биологических методов позволило открыть большое число новых микроорганизмов, расширить, упорядочить, а в некоторых случаях пересмотреть знания о таксономии.

Микрофлора влагалища История вопроса 1836 г. – Donne (Trichomonas vaginalis) 1836 г. – Donne (Trichomonas vaginalis) 1842 г. – Sherer (микроскопия лохий) 1842 г. – Sherer (микроскопия лохий) гг. – Луи Пастер (vibrion butirique) гг. – Луи Пастер (vibrion butirique) 1865 г. – С.Mayerhofer (послеродовые заболевания) 1865 г. – С.Mayerhofer (послеродовые заболевания) 1890 г. – А.И.Замшин (заражение животных) 1890 г. – А.И.Замшин (заражение животных) 1893 г. – В.В.Строганов (диссертация) 1893 г. – В.В.Строганов (диссертация) 1895 г. – А.Додерлейн (классический труд) 1895 г. – А.Додерлейн (классический труд) 41 июля 2013 г.

ВАГИНАЛЬНАЯ ЭКОСИСТЕМА ЭКОСИСТЕМА ВЛАГАЛИЩЕ ВАГИНАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА ВАГИНАЛЬНАЯ СРЕДА

Нормальная микрофлора влагалища облигатная факультативная транзиторная

Исключительно факукультативные анаэробы Энтеробакте- рии Стрептококки Стафило- кокки Облигатные анаэробы Гарднереллы Превотелы Порфиромонады Эубактерии Снитии Лептотрихии Фузобактерии Мегасферы Вейлонеллы Диалистеры Лахнобактерии Клостридии Мобилункусы Пептострептококк и Вагинальный атопобиум Бактерии-ассоцианты БВ Эубактерии Гарднереллы Лептотрихии Фузобактерии Снитии Мобилункусы Пептострепто -кокки Вагинальный атопобиум

Микрофлора влагалища В норме основным компонентом являются лактобактерии В норме основным компонентом являются лактобактерии pH 3,8 – 4,5 pH 3,8 – 4,5 81 июля 2013 г.

Функции нормальной микрофлоры 91 июля 2013 г.

101 июля 2013 г. Нарушения вагинального биоценоза Нарушения вагинального биоценоза связаны с вагинитами и вагинозами. Устойчивость биоценоза к воздействиям обусловлены: генетическими факторами связанными с функционированием иммунной системы, прежде всего врожденного иммунитета; составом биоценоза (вагинальной микрофлоры); внешние факторы (LifeStyle)

Номенклатура бактериального вагиноза 1892 г. – неспецифический вагинит 1955 г. – неспецифический бактериальный вагинит 1955 г. – гемофильный вагинит 1963 г. – коринебактериальный вагинит 1980 г. – гарднереллезный вагинит или гарднереллез 1982 г. – неспецифический вагиноз 1982 г. – анаэробный вагиноз 1983 г. – бактериальный вагиноз 1994 г. – вагинальный бактериоз 1994 г. – вагинальный лактобациллез Аминокольпит, аминовагинит, влагалищные выделения с ключевыми клетками 111 июля 2013 г.

ПЦР - это ДНК-Технология121 июля 2013 г. Баквагиноз причина Причина возникновения не ясна. Считается, что из-за снижения количества лактобактерий, но почему оно снижается? При снижении количества лактобактерий возникает «замкнутый круг»: Снижение кол-ва лактобактерий Уменьшение продукции H 2 O 2 Рост ассоциированных с баквагинозом бактерий Повышение pH

131 июля 2013 г. Как задача постановки диагноза врачом решается сейчас Врач Осмотр Жалобы Микроскопия неокрашенного мазка Лаборатория Посев на флору Микроскопия окрашенных мазков По Граму Метиленовым синим ПЦР Качественная оценка условных патогенов

141 июля 2013 г. Недостатки существующего подхода Посев на флору Длительные сроки культивирования, повышенные требования к транспортировке и хранению материала Не все типы микроорганизмов растут равномерно – в процессе роста теряется соотношение между ними Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Отсутствие возможности культивирования большинства анаэробов Повышенные требования к лаборатории

151 июля 2013 г. Недостатки существующего подхода Микроскопия мазка Субъективность оценки (изменчивость микроорганизмов, необходимость диагностировать много морфотипов) Не все микроорганизмы видны в световой микроскоп ПЦР качественными методами Не дает представления о соотношении микроорганизмов между собой Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Нет количественной оценки

Микроорганизмы урогенитального тракта женщины Патогены Грибы НормофлораДругие В норме отсутствуют Качественная диагностика «есть» / «нет» В норме присутствуют в большом количестве Могут присутствовать Могут присутствовать в малом количестве Необходимость количественной оценки

ПЦР - это ДНК-Технология171 июля 2013 г. Анализ условно-патогенных микроорганизмов Врачу необходима информация о состоянии биоценоза в целом: Информация о соотношении общей обсемененности урогенитального тракта, лактобактерий и различных групп микроорганизмов является ключевой при оценке состояния биоценоза и, как следствие, состояния пациентки Важна количественная оценка групп микроорганизмов, что позволит оценивать динамические изменения состояния биоценоза

181 июля 2013 г. Подход к разработке диагностической системы По литературным данным более 100 различных видов микроорганизмов могут входить в состав биоценоза УГТ у женщин По литературным данным более 100 различных видов микроорганизмов могут входить в состав биоценоза УГТ у женщин Эти микроорганизмы можно сгруппировать по признаку генетического родства Эти микроорганизмы можно сгруппировать по признаку генетического родства Для выявления этих групп и были разработаны реагенты Для выявления этих групп и были разработаны реагенты

191 июля 2013 г. Подход к разработке диагностической системы Колоссальное видовое разнообразие, отсутствие возможности культивирования большинства микроорганизмов и вирусов ( компоненты сред, требования к поверхности, ингибиторы роста, комбинация температуры, давления кислотности, состава атмосферы, накопление токсических продуктов метаболизма, низкая скорость роста, контактное торможение) Необходимо идентифицировать специфические микробные сообщества в их естественной среде обитания без культивирования

201 июля 2013 г. Дополнительно: Выявление Atopobium vaginae регламентировано приказом МЗ РФ N 64 от 21 февраля 2000 г. Раздел микробиологические исследования условно- патогенные облигатные анаэробные микроорганизмы.

211 июля 2013 г. Что такое Фемофлор? Высококлассный метод для исследования УГТ у женщин, позволяющий анализировать состояние биоценоза в целом, оценивать соотношение микроорганизмов между собой. Многофакторный (23 группы микроорганизмов, 25 показателей) Уникальный по составу выявляемых микроорганизмов Количественный Точный Высокая аналитическая чувствительность Высокая аналитическая специфичность Наглядный Быстрый и несложный в использовании (стандартные методики выделения ДНК и ПЦР амплификации) Наличие готовых файлов с программами для ДТ-96 – исключение ошибок и потери времени

Состав комплекта реагентов «Фемофлор» Общая бактериальная масса Лактобактерии Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы) Анаэробные микроорганизмы Микоплазмы Грибы Контроль взятия материала Контроль прохождения реакции Количественная оценка 15 групп микроорганизмов Контроль качества проведенного анализа

231 июля 2013 г. Показания к анализу Исследования биоценозов УГТ женщин репродуктивного возраста Жалобы без клинических проявлений (V,C,U?) Случаи несовпадения клиники и лабораторных исследований Повторные обращения после лечения Оценка эффективности проведенного лечения Оценка восстановления нормофлоры Оценка объема предполагаемой терапии Исследования биоценозов женщин в менопаузе

Как правильно сделать забор материала 241 июля 2013 г.

251 июля 2013 г. Дополнительные лабораторные исследования: Medicus Amicus #2, 2006, Исследование мазка на лейкоциты Качественный ПЦР анализ на безусловные патогены (хламидия, гонорея, микоплазма гениталиум)

261 июля 2013 г. Фемофлор Получен патент на изобретение: от «Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности» РУ ФСР 2009/04663

ПЦР - это ДНК-Технология271 июля 2013 г. Пример бланка выдачи результатов Абсолютные количественные значения Цветовая кодировка % соотношение между ОБМ и условно- патогенными микроорганизмами Заключение

281 июля 2013 г. Состав комплектов реагентов ГруппаВыявляемые показателиФемофлор 4Фемофлор 8Фемофлор 16 Диагностика нормоценоза 1 Общая бактериальная масса 2 Lactobacillus spp. / ВК Аэробные микроорганизмы 3 Сем. Enterobacteriaceae 4 Streptococcus spp. 5 Staphylococcus spp. Анаэробные микроорганизмы 6 Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. 7 Eubacterium spp. 8 Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. 9 Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp. 10 Lachnobacterium spp./Clostridium spp. 11 Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. 12 Peptostreptococcus spp. 13 Atopobium vaginae Группа Микоплазм 14 Mycoplasma (hominis +genitalium ) 15 Ureaplasma (urealyticum + parvum) Грибы 16 Candida spp./контроль взятия материала

291 июля 2013 г. Количественное исследование Для исключения ложноотрицательных результатов предусмотрен контроль взятия материала Интерпретации подлежат результаты со значением контроля взятия материала более 10 4 (4 Log) При КВМ менее 10 4 (4 Log) необходимо связаться с врачом для выяснения состояния пациента или дополнительно взять материал

301 июля 2013 г. Оборудование и программное обеспечение Детектирующий термоциклер ДТ-96, «ДНК-Технология»

ПЦР - это ДНК-Технология311 июля 2013 г. Возможности настройки системы выдачи результатов 1.Изменение уровня отсечки ( Log) 2.Абсолютный и относительный анализ 3.Возможность анализировать результаты по отдельным группам организмов, выставляя индивидуальный уровень отсечки для каждого из них

ПЦР - это ДНК-Технология321 июля 2013 г. Цветовые границы нормофлоры

ПЦР - это ДНК-Технология331 июля 2013 г. Инновационность предлагаемого подхода (1): Чувствительный «инструмент» с возможностью настройки под решаемую задачу, обследуемую группу пациентов, конкретного врача Возможность количественной оценки различных групп микроорганизмов и выявление соотношений между ними Выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphaera, Dialister, Lachnobacterium) Выявление групп микроорганизмов, диагностика которых методом ПЦР до сих пор не была представлена Возможность проведения динамических наблюдений Возможность проведения научных исследований (в том числе и популяционных)

ПЦР - это ДНК-Технология341 июля 2013 г. Инновационность предлагаемого подхода (2): 25 параметров анализа (для Фемофлор 16) Контроль взятия материала Исследование нормофлоры Количественное исследование всех параметров Программное обеспечение, максимально облегчающее работу врача лаборанта: отчет о проведенном исследовании выдается программой в доступной для анализа врача-клинициста форме готовый файл загрузки (Фемофлор.ini) с программой амплификации, что существенно экономит время и исключает ошибки ручного программирования прибора (ДТ-96) определение положения стрипа в термоблоке, позволяющее исправить допущенные ошибки при установке стрипов

ПЦР - это ДНК-Технология351 июля 2013 г. Апробация реагентов прошла в следующих лабораториях: 1.НИИ Акушерства и гинекологии им. Отта (СПБ) 2.ЦНИИА и Г им. Кулакова (Москва) 3.УРНИИ Дерматовенерологии (Екатеринбург) 4.ДЦ Гармония (Екатеринбург) 5.Центр новых мед технологий (Новосибирск) 6.ДНК-Диагностика (Барнаул) 7.ДЦ (Бийск) 8.Ассоциация независимых клинико-диагностических лабораторий «Ситилаб» (Казань) 9.….

Больная Р г/р Жалобы: Выделения, дискомфорт, запах. Считает себя больной в течение года Микроскопия: Лейкоциты Vдо 10 п/з Лейкоциты C до 40 п/з Ключевые клетки -100% Обильная, кокко-бациллярная флора; Посев: обн ur >10 4 mh>10 4 выделения обильные, беловатые свободные, застойная гиперемия вагины, вульвы В зеркалах: Обильные густые молочно- зеленоватые выделения без запаха, рН 4 Заключение: выраженный дисбаланс. Доля анаэробной микрофлоры превышает долю лактобактерий отн. ОБМ. М. и U. присутствуют в количествах, имеющ. диагностическое значение

Больная Г г/р Жалобы: Отсутствуют. Обследование по поводу хламидиоза у партнера Микроскопия: Лейкоциты Сдо п/з Лейкоциты V до п/з Ключевые клетки -0% Смешанная Почкующийся мицелий единич Гиперемия влагалища вульвы, ш/м,рН 5, В зеркалах: Скудные зеленоватые выделения без запаха. Качественная ПЦР: Chlamydia trachomatis – ОБНАРУЖЕНА В посеве: U.u + U.p < 10 4 ; M.h. отр D-z: УГХ, УГК Заключение: умеренный дисбаланс

Больная Е г/р Жалобы: Боли внизу живота. Микроскопия: Лейкоциты Vдо 10 п/з Лейкоциты C до 40 п/з Смешанная, кокко- бациллярная флора В зеркалах: Молочно-зеленоватые выделения в умеренном количестве, рН 5, без запаха Заключение: Аэробный дисбаланс

ПЦР - это ДНК-Технология391 июля 2013 г.

ПЦР - это ДНК-Технология401 июля 2013 г.

Анаэробный баланопостит Gardnerella vag. Bacteroides spp. Fusobacterium spp. Вагиноз- ассоциированная группа анаэробов (чаще всего mobiluncus spp. и Atopobium vaginae) ПЦР - это ДНК-Технология411 июля 2013 г.

ПЦР - это ДНК-Технология421 июля 2013 г.

431 июля 2013 г. Что анализ дает врачу: Оценка биоценоза в целом Более информативен, т.к. позволяет проводить сравнение количества бактериальной массы с лактобактериями – определение объема назначаемой терапии Выявляет микроорганизмы, которые не видны в микроскоп или не растут на питательных средах – определение этиологии инфекционного процесса Возможность проведения динамических наблюдений Анализ гораздо быстрее - результаты могут быть получены в течение суток

441 июля 2013 г. Что анализ дает пациенту 1 визит Полная и информативная диагностика за 1 визит к врачу избежать (полипрогмазии) Анализ позволит пациенту избежать избыточного лечения (полипрогмазии) Индивидуальнотерапия Индивидуально подобранная терапия для каждого пациента контролировать лечение Возможность контролировать проведенное лечение и восстановление нормальной флоры

Изменения в составе набора Уважаемые коллеги! Сообщаем, что произошли изменения в составе набора реагентов Фемофлор. Микоплазма spp. С 1 мая 2010 г. вместо Микоплазма spp. Микоплазма будет регистрироваться отдельно Микоплазма хоминис гениталиум хоминис и гениталиум по двум разным каналам 461 июля 2013 г.

Преимущества 1. Точный 2.Быстрый 3.Высокоспецифичный 4.Выбор правильной терапии 5.Контроль эффективности терапии 6.Прост и удобен в исполнении 7.Есть контроль взятия материала 461 июля 2013 г.

В любую непогоду, Когда грустно и не все получается ПОМНИТЕ, что у нас есть те, кто заботится о нас каждую секунду – ЭТО НАШИ ДРУЗЬЯ НОРМОБИОТЫ!!! ПЦР - это ДНК-Технология471 июля 2013 г.

Спасибо за внимание! 461 июля 2013 г.