Исследование антиоксидантной активности фитопрепарата «Тигровый глаз - орто» Лункин В.В., Поляшова Т.И. НПФ «МЕДИКОМЕД»

Действие активных форм кислорода (АФК) на клетки и ткани Доза АФК Low High Выживаемость Гибель АпоптозНекроз Задержка роста и старение Митогенетическое и пролиферативноедействие Воздействие активных форм кислорода в высоких концентрациях на клетки и ткани приводит к их повреждению и гибели, что является причиной многих заболеваний. АФК в низких дозах способствуют выживаемости

Активные формы кислорода и болезни Генетические аномалии ведут к недостаточности компонентов NADPH оксидазы (CGD) Дисфункция адгезии фагоцитов, ослабление или отсутствие респираторного взрыва, секреторной дегрануляции, апоптоза Аллергии и аутоиммунные заболевания Опухоли и рак Соматические заболевания (сахарный диабет) Дисфункция нейтрофилов

D A N G E R Chemicals Radiation Microbial and virus infection D A N G E R Chemicals Radiation Microbial and virus infection Free radicals ROS Free radicals ROS DNA damage Carcinogenesis Endogenic Exogenic ? Oxygen radicals scavengers

Предпосылки работы. Природные соединения и их композиции являются потенциальными экзогенными «ловушками» АФК и других свободных радикалов и требуют научного анализа для их практического применения. Задача работы состояла в исследовании антиоксидантной активности препарата «Тигровый глаз – орто» на экспериментальных моделях in vitro: нефракционированной крови человека, изолированных гранулоцитах крови человека, ферментативной бесклеточной среде.

Объект и Метод Работа проведена на клетках периферической нефракционированной крови, изолированных гранулоцитах человека и на модели ферментативной реакции Интенсивность генерации АФК была оценена по люминол-зависимой хемилюминесценции с использованием хемилюминометра ХЕМИЛЮМ-12, который позволяет проводить измерения одновременно в 12 образцах. Прибор разработан в Лаборатории клеточной нейробиологии Института биофизики клетки РАН.

ХЕМИЛЮМ-12 Хемилюминометр роторный 12-ячеечный ХЕМИЛЮМ-12 работает с пробами объемом от 0,1 до 0,3 мл, помещаемыми одновременно в 12 ячеек. В процессе регистрации на экране монитора выстраиваются 12 графиков; через каждые 2,5 секунды на каждом из них ставится очередная точка. Одновременная регистрация хемилюминесценции от 12 проб позволяет получить серию измерений с использованием минимального количества исследуемого материала. Высокая чувствительность при стабильном уровне нуля, возможность регистрировать быстрые изменения хемилюминесценции, - все это при большом числе одновременно анализируемых проб малого объема - главные отличительные черты прибора.

Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто» дозозависимо понижал уровень продукции активных форм кислорода (АФК) в цельной крови человека. Высокий уровень АФК в крови является опасным и высокореактивным повреждающим фактором для клеток и тканей организма. Проявление антиоксидантных свойств препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» в цельной крови человека

Нейтрофил - полиморфноядерный нейтрофильный гранулоцит Фагоцитоз Дегрануляция Респираторный взрыв Фагоцитоз зимозана нейтрофилом ( с любезного разрешения Dr. K.B.Pryzwansky) 5 мкм 1 – прикрепление частицы зимозана; 2 – образование псевдоподии вокруг зимозана; 3 - поглощение

Респираторный взрыв 2NADPH + 4O 2 = 2NADP + + 4O H + 0,5-1 nmol/мин/10 6 клеток Повышенная утилизация глюкозыПовышенная утилизация глюкозы Усиленное потребление О 2Усиленное потребление О 2 Активация гексозомонофосфатного путиАктивация гексозомонофосфатного пути Усиленная продукция активных форм кислородаУсиленная продукция активных форм кислорода Активированная продукция АФК Спонтанный уровень продукции АФК

Реактивные формы кислорода HOCl 1O21O2 1O21O2 OH· H2O2H2O2 H2O2H2O2 O2-·O2-· O2-·O2-· NO 2 · SOD O2-O2-·O2-O2-· O2O2O2O2 O2O2 H2O2H2O2H2O2H2O2 H2OH2O H2OH2O Fe 2 Fe 2+ Fe 3 Fe 3+ NO MPO OONO - HOONO H2OH2O + Cl - nitrogen dioxide radical peroxynitrite anion nitric oxide hydrogen peroxide hydroxyl radical singlet oxygen hypochlorus acid superoxide anion radical

Антиоксидантные свойства препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» дозозависимо понижает высокий уровень спонтанной продукции АФК изолированными нейтрофилами человека Клетки были инкубированы с ТГ-орто в возрастающих концентрациях в течение 30 мин при 37 о С

Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» на опосредованную рецептором хемотаксического пептида продукцию АФК изолированными гранулоцитами крови человека Препарат ТГ-орто дозозависимо подавляет развитие респираторного взрыва в изолированных гранулоцитах. Клетки были инкубированы с ТГ-орто в различных разведениях при 37 о С в течение 30 мин, затем активированы 1 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe, чтобы вызвать респираторный взрыв.

Клетки были инкубированы с ТГ-орто в различных разведениях при 37 о С в течение 30 мин, затем активированы 50 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe, чтобы вызвать респираторный взрыв. Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» на опосредованную рецептором хемотаксического пептида продукцию АФК изолированными гранулоцитами крови человека Препарат ТГ-орто дозозависимо изменяет способность гранулоцитов продуцировать активные формы кислорода.

PDK Участники передачи сигнала от рецептора fMLF Рецептор fMLF αiαi GiGi Shc Grb2 SOS GAP ras raf MAPK каскад PI3K PKB/Akt PI3P PLC Ca 2 + DAG PKC PA PLD PA-AK Кальмодулин Ca 2+ -CK

Сигнальные пути, активируемые окислительным стрессом HSF1HSF1 C-JunC-Jun NF-kBNF-kB STATSTAT PLCγ1 PKCPKC PI3KPKBPI3KPKB JAKJAK ERKJNKp38ERKJNKp38 Gene expression changes changes p53p53 Активные Формы Кислорода Активные Формы Кислорода (on J.L. Martindale & N.J. Holbrook, 2002, J.Cell.Physiol.) DNA-PKDNA-PK

Оценка антиоксидантной активности препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто» на модели супероксид-анион продуцирующей ферментативной реакции Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто» дозозависимо ингибирует генерацию АФК в ферментативной бесклеточной реакции «ксантин – ксантиноксидаза». В реакции «ксантин – ксантиноксидаза» продуцируется супероксид-анион радикал Препарат

Выводы: Антиоксидантная активность препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» проявляется в цельной крови, на изолированных клетках и в ферментативной реакции. Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» обладает высокой антиоксидантной активностью в дозах, достигаемых при его разведении более чем в раз. Антиоксидантное действие исследуемого препарата направлено на супероксид-анион радикал, который является исходной формой активных интермедиатов кислорода. Предполагается, что применение препарата может быть полезным при заболеваниях, сопровождающихся дисфункцией фагоцитов, связанной с избыточной нерегулируемой продукцией АФК.

Работа выполнена совместно с сотрудниками Лаборатории клеточной нейробиологии Института Биофизики клетки Российской Академии Наук г. Пущино Благодарности Сафронова В.Г. Мальцева В.Н. Кротова Л.М. Санталов Б.Ф.