Лабораторная диагностика при ВИЧ-инфекции

презентация составлена на кафедре детских инфекционных болезней Государственного учреждения образования «Белорусская медицинская академия последипломного образования» (БелМАПО), Минск, Беларусь (зав. кафедрой профессор А.А. Ключарева) презентация используется при обучении слушателей на курсах повышения квалификации «Лечение и профилактика ВИЧ-инфекции» составитель ассистент Н.В. Голобородько (э-адрес: ) при составлении презентации использованы материалы: скачано с сайта БелМАПО: дата создания презентации – 2005 г., дата последнего обновления: 30 мая 2007 г. данная презентация является только учебным материалом и не может служить справочником по ведению пациентов с ВИЧ-инфекцией; в презентации возможны неточности; авторы не несут ответственности за возможные негативные последствия использования материалов презентации использование и тиражирование данной презентации приветствуется; при использовании хорошим тоном считается ссылка как на нас, так и на авторов процитированных нами материалов

Задачи лабораторной диагностики ВИЧ 1.Определить ВИЧ-статус (да/нет) 2.Исследования у ВИЧ-позитивного пациента: определить стадию ВИЧ-инфекции и прогноз течения, сформулировать показания к терапии, проводить контроль эффективности терапии

Строение ВИЧ: что же мы определяем лабораторно? две нити РНК(-) ферменты: p66 (RT) обратная транскриптаза (ревертаза) p11 (IN) интеграза p32 (P) протеаза структурные белки: р24 (CA) ядерный Ag (внутренняя оболочка) р17 (MA) матриксный Ag липидная оболочка (внешняя, формируется из оболочки клетки человека при выходе новых вирусов почкованием) с вкраплением белков клетки хозяина рецепторный комплекс: gp41 (TM) трансмембранный гликопротеин gp120 (SU) рецепторный гликопротеин антитела спектр антител к разным белкам ВИЧ

Естественное течение ВИЧ-инфекции: клинико-лабораторные параллели пре-СПИД (первые признаки ИД) «асимптомная» инфекция (клиническая латенция) СПИДострая инфекция инк уба ция CD4 VL Ab появление виремии (1-5 сутки от заражения половым путем) появление антител («серологическое окно», ~3-6 недель, до 6 мес) ~opt момент старта АРТ пре- СПИД стадия на лечении старт АРТ

Как скоро после инфицирования ВИЧ сработают различные тесты? цит. по Р. Торстенссону, Шведский институт по контролю за инфекционными заболеваниями, 2005

Тесты для лабораторной диагностики при ВИЧ-инфекции 1.Тесты для диагностики: Скрининговые для определения антител: иммуноферментный анализ (ИФА), в т.ч. быстрые тесты Подтверждающие для определения антител : иммунный блотинг (ИБ); Методы амплификации НК: качественная ПЦР(ДНК-ПЦР) в культуре лимфоцитов крови 2.Тесты для слежения за течением: Методы амплификации НК: количественная ПЦР (РНК-ПЦР, вирусная нагрузка) в плазме Определение иммунного статуса: CD4

Кто подлежит обследованию на ВИЧ? доноры иностранцы из очагов: бывшие в половом контакте с ВИЧ+ лицом или в сходных условиях по риску заражения ВИЧ по клиническим показаниям (при наличии оппортунистических инфекций или ряда возможных признаков иммунодефицита) – как пациенты, так и аутопсийный материал получающие частые гемотрансфузии плацентарная кровь, поступающая на переработку дети от ВИЧ+ матерей или оформляющиеся в госучреждения пациенты с ИППП ПИН, МСМ, ЖСБ поступившие в следственный изолятор или приемник-распределитель медработники в случае профессионального контакта все изъявившие пройти обследование, в том числе анонимно Перечень контингентов, подлежащих обследованию на наличие антител к вирусу иммунодефицита человека. Приложение 8 к приказу МЗ РБ от тестирование на ВИЧ добровольное включение добровольное исключение по желанию (запросу) самого пациента предложение от врача с возможностью отказаться

Диагностический алгоритм обследования на ВИЧ-инфекцию диагноз исключён консультирование и оценка недавнего риска инфицирования ВИЧ диагноз подтвержден +/– ИФА 1 (скрининг) ИФА 2 (скрининг) ИБ (подтвержда- ющий тест) ++ ––– + – повторное обследование в ИФА/ИБ через месяцев или проведение ДНК ПЦР +

Биологические жидкости, в которых можно определять антитела к ВИЧ Сыворотка крови, полученная путем центрифугирования цельной крови Цельная капиллярная кровь (взятая из пальца) Транссудат слизистой полости рта, собранный с помощью специального приспособления (тесты «Oral Fluid», «OMT-EIA») Моча Региональный Учебно-Информационный Центр по проблемам помощи и лечения при ВИЧ/СПИДе в Евразии,

ИФА: принцип метода Ag/Ab сорбированные на твердой фазе (ПХВ планшеты на 96 лунок) определяемые Ab/Ag (исследуемая сыворотка) конъюгат фермента и Ab расщепление хромогена с образованием окрашенного комплекса

Поколения тестов для ИФА * p24 Ag есть в период окна, а затем появляются и обнаруживаются только anti-p24 – то есть ИФА 4поколения помогает в донорстве и у детей с перинатальным контактом, но он не заменяет ИБ как конфирматорный тест определение Abопределение Ag первоеоснованы на нативном вирусенет второе основаны на рекомбинантных белках или синтетических пептидах нет третье в качестве конъюгата меченные белки ВИЧ нет четвертое в качестве конъюгата меченные белки ВИЧ определяют р24 антиген – то есть работают в период «серологического окна» и используются для тестирования донорской крови

ИБ (western blot): принцип метода 1.ЭФ разделение белков ВИЧ-1 (стандартный реагент) по их молекулярной массе специфическое соединение белков ВИЧ с соответствующими отдельными антителами к ВИЧ из добавленной сыворотки 2.Инкубация с добавлением исследуемой сыворотки – специфическое соединение белков ВИЧ с соответствующими отдельными антителами к ВИЧ из добавленной сыворотки 3.Инкубация с добавлением меченных ферментом антител к человеческим Ig 4.Детекция окрашенных полос Э. Фаучи, К. Лэйн, Глава 308 ВИЧ-инфекция

ИБ: трактовка результатов Критерии положительного ИБ : CDC/APHL: сочетание 2 полос, соответствующих любым 2 из 3 антигенов ВИЧ – p24, gp41, gp120/gp160 (максимально чувствительный вариант) ВОЗ: сочетание 2 полос, соответствующих gp41 и gp120/gp160 1.Положительный ИБ к ВИЧ-1 2.Отрицательный ИБ (у здорового человека, иммунизированного белками внешней оболочки ВИЧ-1) 3.Сомнительный ИБ (у инфицированного ВИЧ-2) 4.Сомнительный ИБ (наличие антител, перекрестно реагирующих с p24 Ag) 5.Отрицательный ИБ Э. Фаучи, К. Лэйн, Глава 308 ВИЧ-инфекция

Быстрые тесты выявляют IgM Ab – то есть даже более чувствительны, чем ИФА 1-3 поколений для экстренного уточнения ВИЧ-статуса в медучреждениях (обследование беременных, поступивших рожать с неизвестным ВИЧ-статусом, и обследование биоматериала при профессиональных контактах) – методикой постановки должен владеть любой акушер дежурной бригады и врач приемного покоя для домашнего использования OraQuick® тестполоска каплю цельной капиллярной крови берут из пальца специальной петлей, переносят во флакон c буфером и перемешивают, там осуществляется реакция, и в окошке считывают результат чувствительность 99,6%, специфичность ~100%, время постановки 20 минут «-» тест = здоров, «+» тест => в ИФА и ИБ цит. по A.M. Khalsa, Pacific AIDS Education and Training Center KECK School of Medicine, 2003

Снижение порога доступа к тестированию на ВИЧ Возможность анонимного обследования практически в каждом медучреждении Беларусь«-»: пациенты групп риска (например, ПИН) не всегда мотивированы сдавать кровь в поликлинике Возможность сдать кровь на ПОШ СПб, Россия«-»: за получением результата обращаются не более двух третей сдавших кровь Возможность купить в аптеке быстрый тест некоторые страны ЕС, США «-»: отсутствие консультирования, пациент может напутать даже в простой методике, риск ложных результатов Возможность взять кровь дома самостоятельно и отослать на анализ в лабораторию некоторые страны ЕС, США «-»: отсутствие консультирования, пациент может напутать даже в простой методике проблема: обеспечение качества предоставления услуги ; решения: лабораторный контроль качества (подтверждающий ИБ при «+» быстром тесте, правильная доставка крови в лабораторию) внедрение «горячих линий» для консультирования проблема: приблизить сервис к потребителю ; решения:

Самостоятельный забор материала пациентом и отсылка его в лабораторию определение антител в транссудате слизистых полости рта (не в слюне) подержать между щекой и десной несколько минут, отослать в лабораторию и через 2 недели получить результат в лаборатории: ИФА + ИБ 99.97% из 3570 обследованных имели корректный результат определение антител в крови скарификатором проколоть палец и капнуть каплю крови на бумагу запомнить персональный номер данного теста и телефон, запечатать и отослать бумагу в лабораторию (заполненный конверт прилагается) и по телефону узнать результат теста в лаборатории: ИФА + ИБ цит. по A.M. Khalsa, Pacific AIDS Education and Training Center KECK School of Medicine, 2003

ПЦР: принцип метода обратная транскрипция РНК в кДНК амплификация выделенного ДНК выделение РНК/ ДНК ВИЧ детекция продукта амплификации (ЭФ, ГИФА, фотометрия при real- time ПЦР)

Качественная и количественная ПЦР что определяет материал для исследования клиническое использование качественная ДНК-ПЦР: наличие ДНК ВИЧ, интегрированного в геном клетки- мишени (лимфоцита) – резервуара инфекции культура лимфоцитов крови определение ВИЧ-статуса: - ВИЧ-экспонированные дети (есть антитела, но неясно чьи они); - в период серологического окна – после профессиональных контактов и при наличии клиники острого ретровирусного синдрома (когда у инфицированных ВИЧ антитела еще отсутствуют или субопределяемы) количественная (VL, вирусная нагрузка) РНК-ПЦР: наличие РНК свободных вирионов ВИЧ, находящихся в плазме плазма крови прогнозирование течения ВИЧ- инфекции у пациентов без терапии; контроль эффективности АРТ (стартовая VL и в динамике); выбор тактики родоразрешения у ВИЧ+ беременных

Условная градация уровней VL градация уровней VL, копий/мл методом RT-PCR методом bDNA порог определения< < 500 очень низкий низкий умеренный порог возможного старта прогрессирования ВИЧ-инфекции, требующий дополнительной оценки клинического статуса и уровня CD4-клеток для решения вопроса о начале АРТ > (для детей > ) > высокая>

Трактовка значений VL Ограничения в трактовке: возможны естественные колебания VL в условиях полного благополучия транзиторное повышение уровня VL могут вызвать появление острого эпизода оппортунистической инфекции или вакцинация VL не является стандартным тестом для диагностики ВИЧ-инфекции Что делать? значимыми колебаниями VL следует считать более 3 раз (например, повышение с 20 тысяч до более чем 60 тысяч копий/мл); при сомнениях, выросла ли VL или осталась на прежнем уровне, следует повторить анализ забор крови на VL следует проводить не ранее чем через 2-4 недели после исчезновения симптомов острой инфекции (если невозможно – то все заборы проводить в примерно схожем клиническом состоянии пациента) или вакцинации результаты определения VL должны заново перепроверяться перед стартом или изменением АРВ терапии диагноз ВИЧ-инфекции, выставленный при обнаружении РНК ВИЧ в крови, должен быть подтвержден стандартными тестами – постановкой качественной ПЦР (определение ДНК ВИЧ) или постановкой ИБ (с повтором ИБ спустя 2-4 месяца после начального сомнительного или отрицательного теста)

VL на фоне АРТ: контроль эффективности лечения снижение VL >1,0 lg (>10 раз) снижение VL ниже порога определения – «release point»

Лабораторное обследование детей, рожденных ВИЧ+ матерями возраст частота выявления ДНК ПЦР у вертикально инфицированных ВИЧ детей частота выявления материнских anti-HIV у неинфицированных детей первые 48 часов17-38% дней50-93% 1-2 мес92-98% (1-е обязат. обслед-е) 4-6 мес (2-е обязат. обслед-е) 9 мес 12 мес 15 мес 18 мес0 целесообразность проведения подтверждающего ИБ для определения (материнских) Ab у экспонированных? исключение диагноза ВИЧ-инфекции снятие с дисп. учета ( 2 отр. ДНК ПЦР) ( 2 отр. ИФА) цит. по Ю.А. Фомину и соавт.

Особенности VL у детей в целом дети имеют более высокие уровни VL, высокой считается VL > 100 тысяч копий/мл VL при перинатальной ВИЧ-инфекции: при рождении обычно низкая ( 100 тысяч копий/мл), а затем в течение нескольких лет медленно снижается (в течение первых 2 лет в среднем на 0,6 lg в год, в течение следующих 4-5 лет в среднем на 0,3 lg в год) начальный эффект на АРТ оценивается как достигнутый при снижении VL более чем на 0,7 lg у детей до 2 лет и более чем на 0,5 lg у детей старше 2 лет цит. по Г.М.Цыгановой, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ

Цитофлюориметрическое определение количества CD4-клеток в проточном цитометре клетки крови разделяются по их размеру (объему) добавленные меченные красителем моноклоновые антитела, соединяясь с комплементарными им CD4 рецепторами лимфоцитов/ моноцитов, вызывают изменение окраски рабочего раствора, что определяется фотометрически

Зачем нужно определение CD4? установление стадии (иммунологической категории) ВИЧ-инфекции установление показаний для начала и отмены профилактического лечения оппортунистов установление показаний для начала АРТ слежение за иммунологическим ответом на АРТ (восстановление CD4 при лечении) иммунологическая категория CD4, % от лимфоцитовCD4, клеток/мкл 12 месяцев> 13 месяцев 1 года1-5 лет 6 лет и взрослые отсутствие значимой ИС легкая ИС умеренная («продвинутая») ИС выраженная ИС< 20< 15 < 750< 500 < 200 классификация иммуносупрессии по ВОЗ, 2006

Субпопуляции Т-лимфоцитов у детей: диапазоны нормальных значений 5 дней –3 мес4-8 мес1-2 года2-5 лет>5 лет лимфоциты, % , х 10*9/л 2,9-8,83,6-8,82,1-8,32,4-5,91,1-5,9 CD 3, % , х 10*9/л 2,0-6,52,2-6,51,4-5,41,6-4,20,7-4,2 CD 4, % , х 10*9/л 1,4-5,11,6-4,61,02-3,60,9-2,90,3-2,0 CD 8, % , х 10*9/л 0,6-2,40,7-2,50,5-2,20,6-1,90,3-1,8 B, % 12-22, х 10*9/л 0,2-1,6 CD 16, % 9-16, х 10*9/л 0,09-0,9

Трактовка значений CD4 Ограничения в трактовке: весьма широкий диапазон нормальных значений CD4 на уровень CD4 влияет масса факторов: время суток при заборе, наличие острых заболеваний или вакцинации, вызывающих лейкопению лекарств (например, прием ИНФ-а для лечения ко-инфекции ВГ), стресс, курение, фазы менструального цикла и пр. CD4 в сыворотке не равно CD4 в организме (исследуемый нами сывороточный пул составляет не более 20% всех CD4) нет учета функциональной активности CD4 лимфоцитарные перекресты у детей затрудняют трактовку абсолютных значений CD4 Что делать? забор крови следует проводить в одно и то же время суток, не ранее чем через 1 неделю после исчезновения симптомов острой инфекции (если невозможно – то все заборы проводить в примерно схожем клиническом состоянии пациента) и не ранее чем через 1 неделю после вакцинации не делать заключений на основании единственного результата, а проводить повторное определение CD4 (через месяцев в зависимости от состояния пациента) с клинической интерпретацией при получении сходных результатов у детей первых 6 лет ориентироваться на % содержание CD4, а не на абсолютные значения

Лабораторные данные в формулировке показаний к АРТ клиника СПИДа констатация имеющейся иммуносупрессии основное показание к АРТ уровень CD4 ориентируемся при отсутствии клиники (не всегда существует корреляция клиники и CD4 ! – часто возможно в т.ч. появление клинической симптоматики при нормальных/ некритично сниженных CD4 и наоборот) вирусная нагрузкапрогноз при высокой VL вероятно в ближайшем будущем снизятся CD4 и появится клиника CD4 (иммунный статус) – это «расстояние, оставшееся до пропасти» = констатация стадии VL (вирусная нагрузка) – это скорость, с которой движется поезд = прогноз

Забор и транспортировка материала исследование V крови антикоагулянт подготовка пробытранспортировка Количество CD4 лимфоцитов 3-5 млЭДТАперемешать (недопущение образования сгустка, но не разрушать клетки!) и закрыть до 4 часов (разрушение клеток! дольше - ???) при комнатной t о (не в холодильнике!) Качественное определение ВИЧ 1-2 млЭДТА (не гепарин!, не цитрат!) перемешать (недопущение образования сгустка, но не разрушать клетки!) и закрыть до 4 суток при +2+8 о С (не замораживать!) Вирусная нагрузка/ Лекарствен- ная резис- тентность 2-3 млЭДТА (не гепарин!, не цитрат!) перемешать и закрыть до 6 ч при +2+8 о С (РНКазы!) выделение плазмы – центрифугирование об/мин 20 мин до 1 суток при +2+8 о С, заморозка: -20 о С – 1 месяц -80 о С – 6 месяцев

Забор крови на CD4 и VL в процедурном кабинете ОЦП СПИД процедурный кабинет (забор крови) Ульяновская 3 (район стадиона Динамо), забор крови: Вт, Чт Врачу перед направлением пациента следует предварительно созваниваться с процедурным кабинетом – уточнять о наличии тест-систем и изменениях в графике работы Пациенту с собой иметь заполненное направление от врача лаборатория (консультации по поводу тестов) CD4, ВН и ДНК ВИЧ , любой из врачей-лаборантов резистентность

правильное клиническое решение здравый смысл и клиническое мышление тесный контакт клинициста и лаборанта доказательные медицинские рекомендации засилие рекламы методов диагностики от производителей и финансируемых ими «ученых» «врачебные» и «лабораторные» ошибки диагностики

Ключевые позиции для усвоения Диагноз ВИЧ-инфекции может быть установлен при серологическом обследовании (рутинное тестирование: два ИФА «+» и подтверждающий тест ИБ «+») или при проведении качественной ПЦР двукратно (обычно тестирование детей, рожденных матерями с ВИЧ, и при профессиональных контактах) При тестировании донорской крови период «серологического окна» можно значительно сократить, применяя ИФА тест- системы 4 поколения (определяющие как антитела, так и антиген ВИЧ) или качественную (ДНК) ПЦР Быстрые тесты позволяют предварительно заподозрить диагноз ВИЧ инфекции и применяются в первую очередь в экстренных ситуациях (обследование беременных, поступивших рожать с неизвестным ВИЧ-статусом, и обследование биоматериала при профессиональных контактах) Уровень CD4, наряду с клинической картиной, используется для определения стадии ВИЧ-инфекции – и это отражено в клинических классификациях ВИЧ-инфекции Подъем вирусной нагрузки может указывать на начало прогрессирования ВИЧ-инфекции (прогноз), но не является констатирующим стадию ВИЧ-инфекции показателем. Вирусная нагрузка – главный показатель эффективности АРТ, обязательно контролируемый на фоне проведения лечения Уровень CD4 и вирусная нагрузка – весьма нестабильные показатели, их клиническая интерпретация возможна только при получении как минимум двух согласующихся результатов в динамике (взятых с интервалом ~ месяцев, в зависимости от состояния пациента) Качество лабораторных исследований напрямую зависит от соблюдения правил забора и транспортировки материала

Образовательные ресурсы обзор

Спасибо за ваше внимание!