Маяки и лоции в море современных лабораторных инноваций и технологий

Что мы определяем при лабораторных исследованиях?

Genomics (DNA- 35,000 genes) Геномика Transcriptomics (RNA - 100,000 mRNAs) Транскриптомика Proteomics (Proteins - 1,000,000 proteins) Протеомика Metabolomics (2,500 smoll molecules) Метаболомика

Лабораторные методы исследования 1. Генетические маркеры, кодирующие синтез специфических белков в организме 2. Специфические белки 3.Метаболиты

Протеомика - специфические белки 1. Плазмы крови 2. Органов (клеток) и тканей

Белки тесно связанные с определенными структурами органов и тканей Чем выше их уровень в крови – тем выраженнее повреждение органа Чем выше их уровень в крови – тем выраженнее повреждение органа Чем выше их уровень в крови – тем неблагоприятнее прогноз Чем выше их уровень в крови – тем неблагоприятнее прогноз

Белки, отражающие реакцию органов и систем на различные патологические процессы Не связаны с патологией определенного органа Не связаны с патологией определенного органа Чем выше (ниже) их уровень в крови – тем выраженнее патологический процесс Чем выше (ниже) их уровень в крови – тем выраженнее патологический процесс Уровень повышения в крови с меньшей степенью вероятности отражает неблагоприятный прогноз Уровень повышения в крови с меньшей степенью вероятности отражает неблагоприятный прогноз

Определение специфических белков используют для: 1. оценки риска развития сердечно- сосудистых заболеваний - определение ультрачувствительного СРБ или аполипопротеинов 2. раннего выявления воспалительного процесса, оценки тяжести больного и прогноза течения заболевания - СРБ или прокальцитонин 3. диагностики острого коронарного синдрома - миоглобин, тропонины Т или I

4. диагностики железодефицитных состояний и анемии - трансферрин, ферритин, растворимый рецептор трансферрина 5. ранней диагностики нарушений статуса питания больных - преальбумин, трансферрин, альбумин 6. диагностики повреждений головного мозга - белок S раннего выявления диабетической и артериальной нефропатии - альбумин в моче

Иммунология Проточная цитофлюориметрия с использованием моноклональных антител: –иммунофенотипическая характеристика клеток крови для диагностики гемобластозов; –иммунофенотипическая характеристика клеток крови для оценки иммунного статуса и диагностики иммунодефицитов; –иммунофенотипическая характеристика стволовых клеток

Иммуногематология Группы крови АВ0Группы крови АВ0 Антигены эритроцитов системы Резус Антигены эритроцитов системы Резус Антигены системы Keлл Антигены системы Keлл Антигены системы Даффи (Duffy – антиген Fy), Кидд (Kidd – антиген Jk), MNS (антиген MNS) и Левис (Lewis – антиген Le)Антигены системы Даффи (Duffy – антиген Fy), Кидд (Kidd – антиген Jk), MNS (антиген MNS) и Левис (Lewis – антиген Le)

Масс-спектрометрия - технология MALDI- TOF/MS Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ (от англ. MALDI, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) десорбционный метод «мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой материал, свойства которого обусловливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества. Чувствительность метода:

Кандидаты в биомаркеры сердечной недостаточности (предложено более 60 биомаркеров, отражающих различные патогенетические аспекты сердечной недостаточности) 1. Биомаркеры воспаления: С-реактивный белок (высокочувствительный)С-реактивный белок (высокочувствительный) Фактор некроза опухолей α и его рецепторы Фактор некроза опухолей α и его рецепторы Интерлейкины 1,6,10 и 18Интерлейкины 1,6,10 и 18 Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 (LP-PLA2)Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 (LP-PLA2) Адипонектин Адипонектин

2. Биомаркеры оксидативного стресса: Окисленные ЛПНПОкисленные ЛПНП Миелопероксидаза Миелопероксидаза Биопиррины мочи Биопиррины мочи 3. Биомаркеры ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса: Матричные металлопротеиназы 2,3,9Матричные металлопротеиназы 2,3,9 Тканевые ингибиторы металлопротеиназ Тканевые ингибиторы металлопротеиназ Коллагеновые пропептиды Коллагеновые пропептиды Галектин 3Галектин 3

4.Нейрогормоны: Ангиотензин IIАнгиотензин II Альдостерон Альдостерон Вазопрессин/копептин Вазопрессин/копептин Эндотелин 1Эндотелин 1 Катехоламины (норадреналин, адреналин)Катехоламины (норадреналин, адреналин) Кардиотропин 1Кардиотропин 1 Новые вазодилататоры (адреномедуллин и средняя часть проадреномедуллина, уротензин II, урокортин)Новые вазодилататоры (адреномедуллин и средняя часть проадреномедуллина, уротензин II, урокортин)

5. Биомаркеры повреждения и апоптоза кардиомиоцитов: Тропонин I и TТропонин I и T Легкие цепи миозинкиназы IЛегкие цепи миозинкиназы I Белок, связывающий жирные кислоты Белок, связывающий жирные кислоты МВ-фракция креатинкиназыМВ-фракция креатинкиназы 6. Биомаркеры стресса кардиомиоцитов: Натрийуретические пептиды (предсердного типа, мозгового типа,типа С, N-терминальный пропептид предсердного типа А, про-НПМТ, средняя часть пропептида предсердного типа)Натрийуретические пептиды (предсердного типа, мозгового типа,типа С, N-терминальный пропептид предсердного типа А, про-НПМТ, средняя часть пропептида предсердного типа) Растворимый рецептор ST2 (ST2 является членом семейства рецепторов интерлейкина 1, типичная рецепторная тирозинкиназа)Растворимый рецептор ST2 (ST2 является членом семейства рецепторов интерлейкина 1, типичная рецепторная тирозинкиназа) Фактор дифференциации роста 15 (GDF-15)Фактор дифференциации роста 15 (GDF-15)

7. Экстракардиальные биомаркеры: Цистатин СЦистатин С β-микроглобулинβ-микроглобулин желатиназа-ассоициированный липокаин нейтрофилов (NGAL)желатиназа-ассоициированный липокаин нейтрофилов (NGAL) N-ацетил- D-глюкозаминаза (NAG)N-ацетил- D-глюкозаминаза (NAG) Молекула повреждения почек 1 (KIM-1)Молекула повреждения почек 1 (KIM-1) трийодтиронинтрийодтиронин

Что отражают показатели (специфические белки), полученные с помощью современных технологий?

Универсальная дефиниция ИМ Критерии острого ИМ Инфаркт миокарда - «выявление повышения и/или снижения значений концентрации кардиомаркера [предпочтительно кардиального тропонина (cTn)], по крайней мере, на одно значение, характерное для 99-ой процентили, соответствующей верхнему референсному значению». Т.е.,« 2 х 99-ая процентиль при CV 10%»Инфаркт миокарда - «выявление повышения и/или снижения значений концентрации кардиомаркера [предпочтительно кардиального тропонина (cTn)], по крайней мере, на одно значение, характерное для 99-ой процентили, соответствующей верхнему референсному значению». Т.е.,« 2 х 99-ая процентиль при CV 10%» В дополнение, должен быть, по крайней мере, один из пяти признаков, подтверждающих диагноз ИМВ дополнение, должен быть, по крайней мере, один из пяти признаков, подтверждающих диагноз ИМ -симптомы ишемии -изменения ЭКГ, характерные для новой ишемии (новые изменения ST-T), или новая блокада левой ножки пучка Гисса (LBBB); -развитие патологических зубцов Q на ЭКГ; -«свежая» потеря жизнеспособного миокарда или нарушение региональной подвижности стенки, подтвержденные методами визуализации -обнаружение внутрикоронарного тромба при ангиографии или при аутопсии

Чувствительность биомаркеров к повреждению миокарда

Высокочувствительный тропонин кардиальные тропонины высокочувствительными тестами обнаруживаются почти у 100 % здоровых людейкардиальные тропонины высокочувствительными тестами обнаруживаются почти у 100 % здоровых людей чувствительность методов определения тропонинов повышена в 1000– раз и теперь нижний предел определения (аналитическая чувствительность) может достигать 90 пкг/лчувствительность методов определения тропонинов повышена в 1000– раз и теперь нижний предел определения (аналитическая чувствительность) может достигать 90 пкг/л

Алгоритм серийных измерений hs cTn для диагностики ИМ

Sir William Osler, 1904 The Evolution of Modern Medicine Правила Ослера: 1. Диагноз никогда не ставят по одному результату исследования; необходимо установить тенденцию изменения полученных результатов 2. Чем больше степень отклонения результата от референтной величины, тем выше достоверность наличия патологии

Критерии диагностики сахарного диабета (2010 г. Американская Диабетическая Ассоциация): 1.HbA1c > 6,5 %, или 2. клинические симптомы сахарного диабета и случайно выявленное повышение концентрации глюкозы в плазме крови 11,1 ммоль/л ( 200 мг%) или; 3. уровень глюкозы в плазме крови натощак – 7,1 ммоль/л (( 126 мг%) или; 4. через 2 ч после пероральной нагрузки глюкозой (75 г глюкозы) - 11,1 ммоль/л ( 200 мг%).

Измеряется методом аффинной хроматографии Измеряется методом катион- обменной хроматографии и иммунного анализа Гликозилированный гемоглобин

В 1996 году в США была разработана Национальная программа стандартизации гликозилированного гемоглобина (NGSP). Ужесточение критериев NGSP: 1996 год – точность

Методы определения специфических белков: 1.Электрофорез, включая капиллярный 2. Иммунотурбидиметрия 3. ИФА 4. Иммунохемилюминисценция 5.Масс-спектрометрия 6. Хроматография 7. Микроскопия с использованием моноклональных антител (иммуногистохимия) 8. Флюоресцентная микроскопия с использованием моноклональных антител 9. Микроплашечная и гелевая технологии в иммуногематологии 10. Проточная цитометрия

Физический или химический принцип технологии, т.е. на чем основана технология, ее аналитические возможности и недостатки

Аналитическая чувствительность метода – способность метода выявлять минимальное количество аналита в материале

Эволюция иммуноферментных тест-систем на HBsAg ИФАтест-системы Время появления т/с Чувствительность выявления HBsAg Т/с 1-го поколения Конец 80-х ХХ в. 1,0 МЕ/мл(нг/мл) Т/с 2-го поколения 2-я половина 90-х ХХ в. 90-х ХХ в. 0,1 МЕ/мл Т/с 3-го поколения 2007 г. 0,01 МЕ/мл

Чувствительность метода при использовании меток различных типов Тип метки Пример метки Пределы обнаружения Ферменты Бета-галактозидаза 1.5x моль Пероксидаза хрена 3x моль Щелочная фосфатаза 5x моль Биолюминесценция Ферментное усиление моль Люцифераза светлячков моль Флуоресценция Ион европия (III) 2x моль Флуоресцеин моль Ферменты/ Пероксидаза/люминол/усилитель

Метаболомика

Риск развития атеросклероза и ИБС Оптимальный холестерин-липопротеиновый профиль: общий холестерин – менее 5,17 ммоль/л (200 мг/дл);общий холестерин – менее 5,17 ммоль/л (200 мг/дл); ЛПВП-холестерин – более 1,3 ммоль/л (50 мг/дл);ЛПВП-холестерин – более 1,3 ммоль/л (50 мг/дл); ЛПНП-холестерин – менее 3,4 ммоль/л (130 мг/дл);ЛПНП-холестерин – менее 3,4 ммоль/л (130 мг/дл); триглицериды – менее 1,7 ммоль/л (150 мг/дл)триглицериды – менее 1,7 ммоль/л (150 мг/дл) Гомоцистеин – продукт обмена аминокислот, фактор, определяющий риск развития раннего атеросклероза и тромбоза

Витамин Д (ненасыщенный циклический спирт с 4 двойными связями и боковой цепью эргостерина, одно кольцо в молекуле циклопентанпергидрофенантрена разорвано), в отличие от других витаминов, превращается в гормон, что делает его намного более биологически активным

Система/Орган/Клетка ФункцииПатология Кишечник Абсорбция кальция Мальабсорбция кальция Остебласты Костеобразование и минерализация ОП, остеомаляция, остеодистрофия Остеокласты Костная резорбция Кожа Дифференцировка кераноцитов. Рост и восстановление волос Аллопеция Репродуктивная система Овариальная/тестику- лярная Бесплодие Иммунная система Иммунологический контроль Аутоиммун. забо- левания, опухоли Ренин-ангиотензин- ная система Контроль объема крови Гипертензия Мозг Ментальная функция Болезнь Альцгейм. Локализация рецепторов к витамину Д

В продуктах питания содержание витамина D несущественно Синтез витамина D в коже

Количество месяцев, когда УФ-В лучи солнечного света не приводят к образованию в коже витамина D 3 Вит D круглый год Без вит D >6 мес/год Без вит D 1-6 мес/год Теоретический цвет кожи Вит D круглый год

Обезьяны Старого Света Люди, вся поверхность кожи которых подвергается воздействию УФ-В Зима 43 o Сев. широты Норма Норма Сывороточный 25(OH)D нМ A Статус витамина D у приматов и ранних людей Источники: Cosman, Osteoporosis Int 2000; Fuleihan NEJM 1999; Scharla Osteoporosis Int 1998; Vieth AJCN 1999, Физиологическое потребление взрослыми Содержание в крови при приеме 1000 МЕ/день Жители северных широт, принимающие 4000 МЕ/день

Клинические лаборатории США Тесты, выполнение которых возросло в наибольшей степени за последние 10 лет Тесты, с наибольшей клинической значимостью за последние 10 лет

Геномика и транскриптомика Молекуляно-генетические маркеры рака легких: Circulating Tumor DNACirculating Tumor DNA DNA MethylationB4GALT1, KIF1A, MCAM, RarB, PAK3, SSBP2, TIMP-3DNA MethylationB4GALT1, KIF1A, MCAM, RarB, PAK3, SSBP2, TIMP-3 Messenger RNACK7, EGFR, RUNX3, SCCA, SFTPB, TGFBR3, TRGC2, TRBV9Messenger RNACK7, EGFR, RUNX3, SCCA, SFTPB, TGFBR3, TRGC2, TRBV9 MicroRNAmiR-15b, -21, -27b, -126, -210, p, p, -1254, -let-7d, has-miR-328, has-miR- 26a, has-miR-383, has-miR-92a, msa-miR-662MicroRNAmiR-15b, -21, -27b, -126, -210, p, p, -1254, -let-7d, has-miR-328, has-miR- 26a, has-miR-383, has-miR-92a, msa-miR-662

Биомаркеры для мониторинга трансплантации Орган ПробаБиомаркер Применение Диагностика Прогноз Почки Brandhorst G, Oellerich M. Individually tailored immunosuppres sion: Is there a role for biomarkers? Clin Chem 2011; 57:376– 81. Urine Perforin mRNAXX GB mRNAXX CD103 mRNAX PI-9XX Granulysin mRNAXX IP-10 mRNAX CSCR3 mRNAX FOXP3 mRNAX FasL mRNAX Urine IP-10 ProteinX TIM-3 mRNAX IFN-γ mRNAX

Почки Кровь GB, perforin, FasL mRNA XX CD40L mRNAX IL-4, -5, -6, IFN-γX HLA-DRA mRNAX TNF-α mRNAX IL-8 mRNAX СывороткаAT1R-AAXX Печень Кровь TLRX C3 geneX CXCR, CSCL-10, CSCL9XX Легкие Кровь TLRXX C3 geneX CXCR, CSCL-10, CSCL9XX

5 составляющих в понимании возможностей современных технологий клинической лабораторной диагностики: 1. На чем основана технология 2. Значение технологии для клинической практики 3. Что отражают показатели, полученные с помощью современных технологий 4. Аналитические возможности технологии и ее недостатки 5. Оптимальное сочетание возможностей различных технологий для повышения их клинической эффективности

Выводы: 1. Руководители здравоохранения, клиницисты, специалисты лабораторной диагностики должны понимать, что нам нужно как можно быстрее внедрять и осваивать новые технологии, чтобы окончательно не отстать от уровня развития медицины и лабораторной диагностики развитых стран и, соответственно, качества оказания медицинской помощи населению страны.

2. Следующим шагом является переход с уровня протеомно-метаболической диагностики, который мы пытаемся внедрить в клиническую практику, на генетический уровень диагностики. 3. Генетический уровень требует внедрения в клиническую практику генетических маркеров диагностики сердечно-сосудис- тых, онкологических, эндокринологических и других заболеваний, генетических маркеров подбора и отторжения трансплан- тантов, маркеров особенностей фармакоге- номики лекарственных препаратов в организме больного, генетических маркеров прогноза и исхода заболеваний и т.д.

4. Внедрение генетических маркеров заболеваний в клиническую практику приводит к коренному изменению подходов к профилактике и лечению, и главное, достижению лучших результатов профилактики и лечения.

Что делать? Лучшей альтернативой является сохранение спокойствия?

Что делать? Практически осуществлять переход от кустарных лабораторных мастерских к автоматизированной конвейерной индустрии и внедрять современные технологии в клиническую практику

Смело верь тому, что вечно, Безначально, бесконечно, Что прошло и что настанет, Обмануло иль обманет Все на свете редко стало Все на свете редко стало Есть надежды счастья мало; Не забвение разлука: То блаженство, это мука. М.Ю. Лермонтов