Прикладная генетика для зоологов, лекция 2 Мюге Н. С. Сбор и хранение образцов, выделение ДНК. - презентация

1 Прикладная генетика для зоологов, лекция 2 Мюге Н. С. Сбор и хранение образцов, выделение ДНК.

2 Лекция 2. Сбор и хранение образцов для генетического анализа. Способы фиксации. Хранение образцов для генетического анализа. Выделение ДНК из различных организмов и тканей. Классический фенольный, солевой, щелочной, абсорбция на стекле и др. носителях, колонки. Оценка качества выделения на СФ и сохранности ДНК ( электрофорез ).

3 Сбор материала для генетического анализа Первичная фиксация ( обычно 96% этанолом ). Если зверь большой, берется образец живой ткани в спирт, остальное – как об. Зоологический материал ( формалин, 70% спирт ) Этикетка на месте, с соотнесением всего зверя и образца, вкладывается в обе пробирки Протокол сбора в полевом дневнике ( дата, место, вид, сборщик, что взято куда )

4

5 сбор и первичная фиксация 1. в 96% спирте 2. высушивание ( быстрое ) 3. DMSO 20% + EDTA 4. соль ? 5. RNALATER 6. замораживание

6 Этикетирование карандаш по бумаге и по матовому пластику. ручка Uni-Ball UB-157 ( спирто - нерастворимая ) paint marker (Edding 751 и тоньше ) лазерный принтер на обычной бумаге ( не на кальке и не мелованной ).

7 DMSO для фиксации образцов ( без спирта !) 0.25M EDTA pH % DMSO NaCl saturated 1. Measure out g of EDTA disodium salt with FW for a 250ml solution. (This may be different depending on the FW of your EDTA salt). Add 50ml of deionized water to the EDTA salt and stir. **Make sure to sure EDTA disodium salt otherwise more NaOH is needed to pH the EDTA. 2. Make 1M NaOH to pH the EDTA. The EDTA should be around a pH of 3 or 4 to begin with. It will take roughly 50ml of the 1M NaOH to pH the EDTA to 7.5. The EDTA will then begin to dissolve slowly. Be patient. Heating to 30°C helps. 3. Once all the EDTA salt is dissolved bring the volume up to 200ml with deionized water. Then add the 20% DMSO, which is 50ml for a 250ml solution. Return to a beaker and stir for a few minutes. 4. Add NaCl until it no longer dissolves. Pour the solution into a bottle leaving most of the salt crystals in the beaker.

8 Хранение ? RT +4 С -20 С -80 С Вывод: Оптимальное длительное хранение образцов – в 96%этаноле на –20С - -70С

9 в лаборатории : 1 перезаливка свежим спиртом (96%) 2. этикетирование ( добавление к временной этикетке постоянной ) 3. Проверка и упорядочивание протоколов сбора. Соотнесение с образцом в музейной коллекции (voucher specimen)

10 Экстракция ДНК Стандартный : фенол - хлороформ классичекий. хорошая депроинизация, но : много пробирок и носов, трудоемко, требует тяги или лояльного отношения коллег к запаху фенола. Солевой (NaCl), Ajanabi Две пробирки, дешевые реагенты, не ко всему подходит Адсорбция на стекле (glassmilk) или магнитных частицах Быстро, удобно, требует ОЧЧЕНЬ хорошей отмывки Абсорбция на колонках дорого, но « фирменно »

11 Экстракция ДНК Chelix N1 в криминалистике – образец получается сразу, но не хранится Щелочной Лизис посредством KOH Кипячение Один зверь – одна реакция, для совсем мелких

12 Фенольный метод выделения ДНК 1. Лизис с Proteinase K 2. Экстракция с фенолом (pH>7,8!) 3. Экстракция с PCI (phenol-chlorophorm-isoamilalcohol (25:24:1) 4 Экстракция с CI Осаждение спиртом

13 Подготовка фенола Хранить чистый фенол на -20 С Смешать с 1 объемом 0.5M Tris-HCl, pH=8, перемешать, открутить, слить буфер Смешать с 1 объемом 0.1M Tris-HCl, pH=8, перемешать, открутить, слить буфер Довести pH до 8 ( капая на лакмусовую бумагу ) Хранить под буфером на +4 С

14 Лизисный буфер ( хранить при 4 o С ) DB digestion buffer ( хранить при 4 o С ): Конц. Сток 50ml100ml NaCl0.1M5M1.0ml2.0ml Tris Cl, pH 8.010mM1M0.5ml1.0ml EDTA25mM0.5M2.5ml5.0ml SDS0.5%10%2.5ml5.0ml Proteinase K*0.1mg/ml тв. 20mg/ml 5mg 250µl 10mg 0.5ml H2OH2O mQ43.5ml87ml * - перед использованием.

15 Осаждение ДНК спиртами Высокая ионная сила раствора ( одновалентные катионы : AcNH 4 => 2.0M LiCl => 0.8M NaCl => 0.2M AcONa => 0.3M; + 2.5V 96% EtOH или 1V Изопропанола если требуется добавить какой - либо соосадитель ( линейный PAA, tRNA, гликоген. Осаждение улучшается, если добавить MgCl 2 до 10mM. (molbiol.ru) Перемешать, охладить, открутить, слить Промыть 70% этанолом (2 раза ) Подсушить спирт с осадка, растворить в TE или воде

16 Протокол выделения ДНК по Aljanabi SM, Martinez I. 1. Гомогенизировать свежую ткань в 400 мкл стерильного буфера для гомогенизации : 0.4 M NaCl 10 mM Tris-HCl pH mM EDTA pH 8.0 в гомогенизаторе 10 – 15 сек мкл 20 % SDS (2 % конечная концентрация ) и 8 мкл 20 мг / мл протеиназы К (400 мкг / мл конечная концентрация ), хорошо перемешать, инкубировать 55 – 65 0 С как мин. 1 час или на ночь мкл 6 М NaCl ( насыщенный р - р ) 4. Перемешать на вортексе с максимальной скоростью 30 сек 5. Центрифугировать 30 мин g 6. Супернатант перенести в новый эппендорф 7. + Равный объем изопропанола, хорошо перемешать, инкубировать С 1 час. 8. Центрифугировать 20 мин при 4 0 С g 9. Сполоснуть осадок 70 %- ым этанолом, высушить и ресуспендировать в 300 – 500 мкл стер. дист. воды. Ориентировочно – около 3 часов ( с поправкой на шаг 2). Nuclec Acids Research, 1997, Vol.25, No 22, 4692 – 4693

17 Осаждение CTAB DNA + CTAB ( из 5% стока ) до %; 2'-ON NT; ЦФ 10'. растворить в буфере с высокой ионной силой, переосадить спиртом. CTAB (Cetrimide CH 3 (CH 2 ) 15 N(CH 3 ) 3 Br, Mw=364.5) CTAB сильный детергент. Он эффективно разрушает ДНК белковые комплексы. Комплекс нуклеиновых кислот с CTAB растворим только в высокой соли (2M LiCl, 1M NaCl). Для очистки нуклеиновых кислот раствор нуклеиновых кислот в 1.5M NaCl, 2% CTAB можно экстрагировать хлороформом. CTAB образует нерастворимый комплекс с DNA при концентрации соли ниже, чем 0.5M ( выпадает в осадок при добавлении 2-2.5V EtOH или 0.7V изопропанола ). Полисахариды, мембраны, фенолы и т. п. при этом не осаждаются. После осаждения, для очистки от остатков CTAB требуется переосаждение, осадок лучше сполоснуть 80% спиртом (CTAB в нём растворим ).

18 Протокол выделения ДНК Гаджиевским набором 1. Приготовление рабочего раствора солевого буфера. 10 Мл 10- кратного солевого буфера перенести в цилиндр, довести бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96% этиловым спиртом до метки 300 мл и перемешать. Хранить при 4° С. 2. В пробирку объемом 1.5 мл внести 100 мкл исследуемой пробы, добавить 400 мкл Лизирующего реагента и перемешать переворачиванием 5-10 раз. Не встряхивать. 3. Термостатировать пробирку со смесью 5-7 минут при 65° С (30-40 минут при выделении из сухого материала ). 4. Если смесь содержит нерастворившиеся элементы центрифугировать 10 сек при 5000g. Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку. 5. В пробирку с чистой смесью добавить 20 млк суспензии сорбента NucleoS ( перед использованием NucleoS интенсивно встряхнуть на вортексе ). 6. Пробирку перемешивать на ротаторе 10 мин. 7. Центрифугировать 10 сек при 5000g. 8. Осторожно удалить супернатант с помощью водоструйного насоса. 9. К осадку добавить 200 мкл Лизирующего реагента и тщательно перемешать на вортексе. 10. Добавить в пробирку 1 мл солевого буфера и перемешать переворачиванием 5-10 раз. 11. Центрифугировать 10 сек при 5000g. 12. Осторожно удалить супернатант с помощью водоструйного насоса. 13. Добавить в пробирку 1 мл солевого буфера, перемешать на вортексе центрифугировать 10 сек при 5000g и осторожно удалить супернатант с помощью водоструйного насоса. 14. Добавить в пробирку 1 мл солевого буфера, перемешать на вортексе центрифугировать 10 сек при 5000g и осторожно удалить супернатант с помощью водоструйного насоса. 15. Просушить осадок при 65° С. 16. Внести в пробирку 50 мл ЭкстраГена (100 мкл если выделение производиться из богатой ДНК пробы ). ЭкстраГен следует отбирать из общего объема при постоянном перемешивании. 17. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе до получения гомогенной суспензии. Термостатировать 4-5 мин при 65° С. 18. Центрифугировать 1 мин при 10000g. 19. Перенести водный раствор ( с ДНК ) в новую пробирку.

19 Worm lysis buffer No. ChemicalsF.W.StockFinal1 ml2 ml5 ml 1KCl (Sigma, P-9541)74.56g 1M50 mM 50 µl100 µl250 µl 2 Gelatin* (Dicto Bacto, ¼ lb) 1%0.05 %50 µl100 µl250 µl 3 Tris pH 8.2 (BioRad, ) g1M10 mM10 µl20 µl50 µl 4 Tween 20 (Fisher, FL ) g 100%0.45 %4.5 µl9 µl22.5 µl 5 Proteinase K (Roche, , 1gm) 20mg/ml60µg/ml3.3 µl6.6 µl16.5 µl 6 MgCl 2 (From PCR reagents) 95.21g1M2.5 mM2.5 µl5 µl12.5 µl 7ddH 2 O880 µl1760 µl4400 µl

20 A. WLB (Worm lysis buffer): after Williams et al., 1994 Genetics 131:60 WLB (Worm lysis buffer): (*: made fresh, 100mg gelatin in 10ml water and heat in microwave) 1. Many worms 1.Add 50 µl lysis buffer to tissue sample (approximately 0.5 cm) in a 0.5 ml PCR tube. 2.Place at -70ºC > 15min. Can store for several days. Or put in liquid nitrogen to 55ºC water bath for 10 times to help break down the nematode body. 3.Warm to room temperature and add 1 drop mineral oil. 4.Incubate at 60ºC > 1 hour. Vortex at least once during incubation to help breakup tissue. 5.Heat to 95ºC for 15 min. (Kills off Proteinase K). 6. Cool to 4ºC. 7. Vortex briefly (2-3 sec). 8.Spin at 6,000 rpm for 30 sec. 9.Use 1 µl supernatant as template for PCR amplification for 25 µl reaction. 2. Nematodes-for single worm 1.Add 15 µl lysis buffer to worm in a 0.5 ml PCR tube. 2.Place at -70ºC > 15 minutes. Can store for several days. 3.Warm sample to room temperature and add mineral oil. 4. Incubate at 60ºC > 1 hour. e. Heat to 95ºC for 15 minutes f. Cool to 4ºC. g. Pipet sample up and down to mix h. Use 2.5 µl as template for PCR amplification.

21 Сравнение разных методов выделения ДНК из волоса

22 Использование максатазы ( и прочих ферментов стиральных порошков ) вместо протеиназы К Выбрать синие гранулы в стиральном порошке фирмы Henkel, растворить в воде Добавить в 10 мл воды 300 мг NaCl, несколько синих гранул, щепотку порошка ( детергент ) и кусочек исследуемой ткани Поставить на батарею и перемешивать сутки ( кусочек ткани должен полностью раствориться Добавить 30 мл холодного ( из морозилки ) этанола Накрутить медузу на скрепку Промыть в 70% спирте Растворить в воде Хранить в морозильнике