Учебное пособие Малышев И. Ю., Филатов О. Ю.. Полимеразная цепная реакция – это технология умножения ( амплификации ) генетического материала. - презентация

1 Учебное пособие Малышев И. Ю., Филатов О. Ю.

2 Полимеразная цепная реакция – это технология умножения ( амплификации ) генетического материала

3 Один цикл ПЦР, при котором количество генетического материала удваивается, включает три этапа. Первый этап: денатурация двухцепочечной ДНК. Второй шаг (называемый отжигом) – комплементарное соединение полученных одноцепочечных молекул ДНК с праймерами. Третий шаг – полимеразный синтез второй цепочки ДНК, начинаемый с присоединенных к обеим цепочкам ДНК праймеров. Powledge T.M. The polymerase chain reaction. Adv Physiol Educ. 2004; 28: 47.

4 Для визуализации результатов амплификации применяют метод горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле, в состав которого добавляют специальный краситель ДНК -бромистый этидий. При этом, двигаясь с разной скоростью в электрическом поле, фрагменты ДНК разделяются по размеру, образуя характерную картину полосок. Гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм)

5 В медицине - диагностика инфекций В медицине - определение генетических вариаций и мутаций В медицине - установление отцовства В биологии и биотехнологии –секвенирование ДНК и клонирование генов В биологии –выявление эволюционного родства среди организмов В криминалистике –сравнение генетического материала с места преступления с генетическим материалом подозреваемого

6 Моноклональные антитела – это антитела, специфичные к одному эпитопу и продуцируемые одним В - клеточным клоном называются моноклональными

7 Получение мышиных моноклональныех антител проводят в 4 стадии: 1) иммунизация, 2) получение клеток миеломы, 3) гибридизация иммунных В-клеток с клетками миеломы и селекция, 4)скрининг и исследование свойств полученных антител. Powledge T.M. The polymerase chain reaction. Adv Physiol Educ. 2004; 28: 47.

8 ППР –оптический биосенсорный метод, позволяющий в реальном режиме времени регистрировать взаимодействие молекул. Лазерный пучок света, проходящий через призму, падает на поверхность, покрытую золотом. Свет отражается от поверхности по всем направлениям за исключением критического угла. Лазерный пучок в этом направлении возбуждает плазмонную волну на поверхности металла, что и вызывает падение интенсивности отраженного света. Величина критического угла строго зависит от коэффициента преломления слоя, прилегающего к поверхности сенсора. Таким образом, оценивая изменения критического угла с течением времени, можно определить изменения, происходящие на поверхности сенсора

9 В научных исследованиях (например, эпитопное картирование антигена) В диагностике (диагностика инфекций, гистопатологическая диагностика аутоиммунных заболеваний, злокачественных опухолей и т.д.) В терапии (химерные антитела)

10 Химерные антитела – это антитела, имеющие в своей структуре составные части, происходящие из различных источников ( видов антител )

11 Ген вариабельного домена мышиного антитела клонируется и экспрессируется в системе вместе с генами константного домена человеческого антитела. Получают гибридные антитела с мышиным Fab- и человеческим Fc-доменом. Химерное антитело содержит 30-35% мышиного и 65-70% человеческого белка Химерные антитела первого поколения В этом подходе используются лишь минимальные фрагменты мышиного антитела, которые определяют его комплементарность к антигену, эти фрагменты встроены в структуру человеческого антитела. Получаемые таким образом антитела больше похожи на человеческие, чем антитела первого поколения, и потому менее иммуногенны. антитело содержит 10% мышиного белка и 90% человеческого белка. Гиперхимерные (гуманизированные) антитела второго поколения Биспецифичные антитела получают из моноклональных антител, специфичных к разным антигенам. Так, например, биспецифическое антитело, применяемое для лечения опухоли, одним плечом гипервариабельного домена связывается с поверхностным антигеном опухолевой клетки (HER2), а другим с антигенным рецептором Т-клетки (CD3), что обеспечивает их тесный контакт. Биспецифические гуманизированные антитела

12 Первый этап Получение и амплификация одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) Второй этап С помощью генной инженерии, ДНК, кодирующую scFv- фрагмент антитела «вставляют» в ген оболочечного белка бактериофага, так что в итоге на поверхности фага оказывается составной белок, включивший в свою структуру scFv-фрагмент Стадии биотехнологического процесса

13

14 Структура человеческого антитела (А), Fab-фрагмента (В) и одноцепочечного Fv- фрагмента (C) scFv. VH,вариабельная область тяжелой цепи; VL,вариабельная область легкой цепи; CH,константная область тяжелой цепи; CL,константная область легкой цепи // Smith K.A., Nelson P.N., Warren P., Astley S.J., Murray P.G., Greenman J. Demystified… recombinant antibodies. J Clin Pathol 2004; 57: 914.

15 Иммуногистохимическое окрашивание рака ободочной кишки с применением фаговых антител, специфичных к фактору роста эндотелия, х 40 // Smith K.A., Nelson P.N., Warren P., Astley S.J., Murray P.G., Greenman J. Demystified… recombinant antibodies. J Clin Pathol 2004; 57: 915. Фаговые антитела применяют в качестве лабораторных реагентов, заменяющих обычные антитела, например, в проточной цитометрии или иммуногистохимическом и иммуноферментном анализах Фаговые антитела могут применяться в терапевтических целях, например для лечения злокачественных новообразований

16 Генные вакцины – это вакцины, включающие в своей основе гены микроорганизмов, один или несколько, кодирующие белки патогена

17 Виды генных вакцин ДНК-вакцины (первого и второго поколения) Вирусные рекомбинантные вакцины

18

19 Растительные вакцины – это вакцины, созданные на основе растений, в геном которых введены необходимые гены, заставляя эти растения производить зашифрованные инородными генами белки. Такие растения будут называться трансгенными.

20 Инородную ДНК в геном растения можно ввести двумя способами: путем бомбардировки из генной пушки культур эмбриональных растительных клеток в суспензии, либо, с помощью Agrobacterium tumefaciens Антигены, содержащиеся в трансгенных растениях, имеют возможность попасть в кишечник, не разрушаясь по дороге, т.к. наружная стенка клеток растений защищает их от воздействия желудочного сока В кишечнике освобожденные из растительных клеток антигены захватываются М- клетками, а затем попадают в пейеровы бляшки и в регионарные лимфоузлы, где они могут быть представлены АПК. В результате индуцируется иммунный ответ – как локальный, так и системный

21 растение достоинства недостатки табак удобство хранения вакцины (множество семян, хранящихся длительное время), большой урожай, получаемый быстро содержит токсичные компоненты картофель много клинических исследований, легко трансформировать и размножать из «глазков», долго хранится без заморозки необходимо готовить, что приводит к разрушению антигена. бананы не нуждаются в кулинарной обработке, часто произрастают в развивающихся странах для созревания необходимо 2-3 года, трансформированный растения дают плоды через год, плоды быстро портятся после сбора, содержат мало белка помидоры быстро растут, содержат много витамина А, потенцирующего иммунный ответ, можно избежать проблему быстрой порчи плодов путем применения сухой заморозки быстро портятся рис высокая экспрессия белка, экспрессируемые белки не разрушаются при кулинарной обработке, легко хранить и транспортировать медленно растет, сложно выращивать салат-латук быстро растет, не нуждается в кулинарной обработке быстро портится соя большой урожай, получаемый быстро дыня канталупа быстро растет, легко трансформировать

22

23 Лекарственные препараты, применяемые в лечебной практике рекомбинантные вакцины – белковые (пептидные) или генные рекомбинантные антитела и слитые (химерные) белки рекомбинантные цитокины (интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухоли и др.) и антагонисты рецепторов цитокинов

24

25

26 Слева направо: бластоцисты; процедура комплемент-индуцированного лизиса трофобласта; полученные клетки внутренней клеточной массы (ЭСК).

27

28 Первый этап добавление в культуральную среду определенных ростовых факторов Второй этап совместное культивирование и трансплантация ЭСК с клетками, индуцирующим и дифференцировка ку Третий этап имплантация ЭСК в органы животных Четвертый этап стимуляция экспрессии генов, действующих на ранних стадиях эмбриогенеза Стадии биотехнологического процесса

29 Линия Н1 человеческих ЭСК была трансфецирована лентивирусным вектором, содержащим ген EGFP, затем были отобраны колонии гомогенно зеленого цвета (флуоресцентная окраска на продукт трансгена EGFP). (а и b) фазово-контрастное и флуоресцентное изображение EGFP-экспрессирующей колонии Н1 при 71 пассаже. (с,e и f) иллюстрация недифференцировкаанного фенотипа и продолжающейся экспрессии трансгена при 122 пассаже ЭСК: окрашивание на ранние маркеры СК Oct-4 (с) и щелочную фосфатазу (f), а также на EGFP (e). Окраска хромосом красителем DAPI (d).

30 (Слева) мышиные ЭСК выращивают на фидерном слое из клеток линии ОР9, с последующим переселением на клетки линии DII-1+ OP9, а затем переселяют в органную культуру клеток фетального тимуса (FTOC). Трансплантация тимической органной культуры, населенной ЭСК, мышам RAG/ приводит к генерации функциональных Т-лимфоцитов, активирующихся при воздействии вируса. (Центр) человеческие ЭСК формируют эмбриоидные тельца за 10-дневный промежуток, из этих телец изолируются клетки CD45, PECAM-1+, Flk-1+, VE-кадгерин +, выращиваются в бессывороточной среде и затем инъецируются в бедренную вену мышей. При этом получают несколько прижившихся линий кровяных клеток, но Т-лимфоцитов среди них нет. (Справа) человеческие ЭСК культивируют на фидерном слое ОР9 в течение дней, затем изолируют CD34+ и CD33+ клетки. Тем временем мыши линии RAG/ или мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) с приживленным под почечной капсулой трансплантатом, состоящим их фрагментов человеческого тимуса и печени, подвергаются облучению и полученные в культуре клетки-предшественники инъецируются в тимико- печеночный орган-трансплантат. Последующие биоптаты трансплантата содержат функциональные Т-лимфоциты, которые могут быть активированы антителами к CD3 in vitro.

31

32 Трансплантация СК при лейкозах Трансплантация СК при врожденных заболеваниях крови Трансплантация СК при аутоиммунных болезнях Трансплантация СК при сахарном диабете

33 Эффекторные иммуноциты, секретирующие цитокины Т- хелперы (в том числе, клетки памяти) и секретирующие аутоантитела плазматические клетки играют ключевую роль в аутоиммунной реакции. Кроме того, активированные АПК также принимают активное участие в инициации и поддерживании аутоиммунного воспаления. (по Radbruch A., Thiel A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? Ann Rheum Dis. 2004; 63(Suppl 2): 97)

34 (А) хроническая аутоиммунная реакция нарушает гомеостаз периферических популяций иммуноцитов. (В) При иммуноабляции антитимоцитарный глобулин (ATG) и антилимфоцитарный глобулин (ALG) элиминируют долгоживущие плазматические клетки, АПК, а также лимфоциты памяти, в то время как циклофосфамид (Су) препятствует дифференцировкаке В- и Т-лимфоцитов памяти в эффекторные иммуноциты. (С) Аутологичные стволовые клетки подвергаются очистке с тем, чтобы не допустить реинфузии аутореактивных лимфоцитов. Происходит замена иммунных лимфоцитов на наивные Т- и В-клетки, что приводит к установлению толерантности и нормального иммуноцитарного гомеостаза. (по Radbruch A., Thiel A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? Ann Rheum Dis. 2004; 63(Suppl 2): 99.)

35 (А) Захват аутоантигена слизистыми может привести к индукции in vivo регуляторных Т- лимфоцитов, продуцирующих ТФР (Th3- клетки) или ИЛ-10 (Tr1-клетки). Оба типа регуляторных лимфоцитов негативно влияют на активированные АПК, представляющие аутоантиген, кроме того, цитокины ТФР и ИЛ-10 модулируют функции Т-лимфоцитов. Однако активные хронические иммунные реакции могут быть рефракторными к модуляции посредством индукции оральной толерантности. (В) альтернативная стратегия включает изоляцию регуляторных Т-лимфоцитов из периферической крови ациентов с аутоиммунной реакцией. После изоляции аутоантиген-специфичные регуляторные Т-лимфоциты можно размножить in vitro и ввести обратно тому же пациенту. В месте аутоиммунного воспаления эти клетки активируются АПК, а затем подавляют иммунную реакцию, конкурируя с антиген-специфичными Т- лимфоцитами за взаимодействие с антигеном, а также секретируя противовоспалительные цитокины. (по Radbruch A., Thiel A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? Ann Rheum Dis. 2004; 63(Suppl 2): 100.)

36

37 Стволовая клетка при делении образует еще одну стволовую клетку и специализированную клетку. Клетка- предшественник уже частично специализирована и при делении образует две специализированные клетки.

38

39 Иммуномодулирующий эффект мезенхимальных стволовых клеток подавляют размножение стимулированных Т-клеток подавляют пролиферацию В-лимфоцитов и угнетают синтез антител, рецепторов хемокинов, осуществляемый активированными В-клетками препятствуют дифференцировкаке моноцитов в незрелые дендритные клетки и созреванию незрелых дендритных клеток, угнетают экспрессию дендритными клетками костимуляторных молекул и цитокинов влияют на функции естественных киллеров (снижение секреции интерферона, снижение пролиферации неактивных NK-клеток)