АО «Медицинский университет Астана» Кафедра внутренних болезней Методы лабораторной диагностики ( тест Шелли, ЕРОК, гистаминовые и лейкотриеновые тесты, определение триптазаны, Ig G и его субклассов). Баймағамбет Айгерім 614-ВБ Астана 2017 год

Диагностика аллергии (аллергических заболеваний) Расспрос больного (сбор аллергологического анамнеза) при аллергических заболеваниях; Физикальное обследование; Нозологическая диагностика при аллергических заболеваниях; Патогенетическая диагностика при аллергических заболеваниях; Лабораторные методы при аллергических заболеваниях; Показания для исследования уровня IgE-специфических антител; Этиологическая диагностика при аллергии.

БАЗОФИЛЬНЫЙ ТЕСТ (греческий basis основа + philia склонность; синоним тест Шелли) метод диагностики специфической сенсибилизации организма, основанный на дегрануляции базофилов после добавления к ним специфического аллергена. Предложен Шелли (W. В. Shelley) в 1962 году. В последующие годы базофильный тест использован различными исследователями для изучения пыльцевой, лекарственной и пищевой аллергии.

Существует две разновидности базофильного теста: 1. прямой тест, при к-ром реакция дегрануляции воспроизводится на спонтанно сенсибилизированных базофилах больного (лейкоциты больного + аллерген); 2. непрямой тест, при котором реакция дегрануляции воспроизводится на базофилах кролика или здорового человека (лейкоциты + исследуемая сыворотка больного + аллерген); в реакции лучше использовать лейкоциты кролика, содержащие много базофилов (412%). Непрямой тест получил большее распространение.

Материалы, используемые для прямого базофильного теста: 1)свежая кровь больного; 2)аллерген, повышенную чувствительность к которому предполагается исследовать; 3)фиксирующий раствор (6 мл этанола, 2 мл хлороформа и 2 мл ацетона); 4)целлюлозные мембранные фильтры.

Методика прямого базофильного теста Смешивают 0,25 мл гепаринизированной крови больного и 0,025 мл аллергена. Через 5 минут к 0,1 мл смеси добавляют охлажденный фиксирующий раствор, который разрушает эритроциты, оставляя интактными лейкоциты. После фиксации в течение ночи при t° 4° лейкоциты ресуспензируют и фильтруют через целлюлозные мембранные фильтры в течение 20 минут.

При этом базофилы остаются на фильтрах. Фильтры окрашивают в течение 30 секунд раствором толуидинового синего, обезвоживают в этаноле и просветляют в ксилоле. Подсчитывают 20 базофилов. Их классифицируют по размеру, окраске, числу и локализации базофильных гранул. Для «истощенных» базофилов характерно: 1) небольшое количество гранул; 2) небольшие слабо окрашенные гранулы; 3) значительное количество гранул, расположенных за пределами клетки. Тест считается положительным, если «истощено» (дегранулирует) больше половины базофилов.

Материалы, используемые для непрямого базофильного теста: 1) свежая или сохраняемая при t°20° сыворотка крови больного; 2) аллерген; 3) концентрированная взвесь лейкоцитов кролика, полученная при центрифугировании гепаринизированной крови со скоростью 3000 об/мин в течение 5 минут в тонких стеклянных пробирках или полиэтиленовых трубочках; 4) предметные стекла, окрашенные раствором нейтральрота. Для каждого аллергена опытным путем подбирают ту концентрацию, которая не вызывает неспецифических изменений базофилов.

Методика непрямого базофильного теста На окрашенное нейтральротом предметное стекло наносят одинаковое количество (по 0,005 мл) лейкоцитарной взвеси, исследуемой сыворотки больного и аллергена. Предметное стекло накрывают покровным, края которого смазаны вазелином, и ставят на 10 минут в термостат (при 37°).

Параллельно ставят контрольные пробы: 1) исследуемая сыворотка со взвесью лейкоцитов (чтобы исключить неспецифическую дегрануляцию); 2) взвесь лейкоцитов с аллергеном. Реакцию наблюдают под микроскопом с иммерсией. Считают не менее 20 базофилов. Основные признаки повреждения базофилов следующие: разбухание и потеря сферичности, гранулолизис, выход гранул из клеток. Полное разрушение клетки с выходом гранул в окружающую среду («взрывчатая» дегрануляция) наблюдается крайне редко.

Выделяют 3 степени: 1) слабая реакция (+) дегрануляция при базофильном тесте превышает таковую в контроле на 10%; 2) умеренная реакция (+ + ) превышение дегрануляции в контроле на 15%; 3) резко положительная (+ + + ) превышение дегрануляции в контроле на 20% и более.

Гистаминовые и лейкотриеновые тесты Измерение высвобождения гистамина и лейкотриенов из базофилов после инкубации с аллергеном ценный исследовательский метод диагностики аллергии in vitro, хотя данный метод используется лишь в некоторых крупных специализированных центрах

Определение уровня триптазы Триптаза - маркер дегрануляции тучных клеток. Повышение уровня триптазы в крови на активацию тучных клеток, это есть фактором риска острых аллергических реакций.

Увеличение базового уровня Триптазы – фактор риска развития острых реакций при любых видах анестезии; Пациенты зоны риска развития острых реакций при контакте с ядом насекомых и лекарственными препаратами; Увеличение базового уровня Триптазы указывает на активацию тучных клеток и может служить фактором риска острых реакций при хирургических манипуляциях; Триптазу необходимо измерять перед началом иммунотерапии; До 25 % пациентов с острыми реакциями на яд насекомых имеют мастоцитоз. Уровень Триптазы соответствует остроте мастоцитоза; Триптаза – маркер рецидива Острой миелоидной лейкемии.

Подготовка пациента: Сдача крови натощак. Материал: Сыворотка крови. Факторы, искажающие результат: 1. Гемолиз; 2. Хилёз. Стабильность пробы: 7 дней при температуре 2-8 °C и 6 месяцев при температуре -20 °C. Замораживать только один раз. Метод: иммунофлюоресцентный. Анализатор: Phadia 100. Тест – система: ImmunoCAP (Phadia AB). Референсные значения (норма): sIgE норма < 10 мкг/л; больше 10 мкг/л группа риска; больше 20 мкг/л системный мастоцитоз; больше 200 мкг/л гематологические неоплазмы.

Основные показания к назначению анализа: 1. Диагностика системного/кожного мастоцитоза; 2. Оценка степени дегрануляции тучных клеток; 3. Оценка риска возникновения и прогнозирование тяжести анафилактических; реакций при проведении аллерген-специфической иммунотерапии; 4. Подтверждения случая анафилактической реакции. Интерпретация результатов: Положительный результат: 1. Мастоцитоз; 2. Анафилактическая реакция накануне; 3. Высокий риск анафилактической реакции при проведении аллерген- специфической иммунотерапии; 4. Выраженная сенсибилизация организма.

Определение Ig G и его подклассов Имеется 4 подкласса IgG (IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4). Нарушение распределение подклассов бывает даже в тех случаях, когда уровень общих IgG находится в пределах референтных значений. В настоящее время имеются реагенты для тестирования всех подклассов IgG, позволяющие диагностировать их дефицит.

IgG 1 основной реактант при формировании антител против полисахаридов оболочки вирусов и капсулы бактерий, активирует систему комплемента, эффективно связывается с лимфоцитами через Ре- рецепторы формирует аутоантитела IgG 2Отвечает за иммунный ответ на полисахаридные антигены пневмококков, стрептококков группы А и Haemophilis influenzae IgG 3 антитела с высоким сродством к белковым антигенам самые сильные активаторы комплемента эффективно связываются с лимфоцитами через Ре- рецепторы формирует аутоантитела IgG 4 реакция на хроническую антигенную стимуляцию иммунный ответ на аллергены даже после гипосенситизации блокирование IgE-зависимых реакций

CAST Тест на лекарственную непереносимость - CAST (Cellular Antigen Stimulation Test) также называют провокационным тестом in vitro. Метод патентован, авторы - проф. De Weck и д-р Sainte-Laudy в 1994 г. CAST обладает высочайшей специфичностью по сравнению с классическим тестом высвобождения гистамина.

Метод имеет 100% специфичность. Использование CAST-теста позволяет избежать применения опасных для жизни провокационных тестов и не несет никакого риска для пациента. Пациент сдает кровь в лаборатории и приносит с собой конкретный лекарственный препарат на который подозревается аллергическая реакция.