Современные технологии анализа точечного нуклеотидного полиморфизма. Генотипирование человека.

Методы анализа SNP Ферментативные подходы: RFLP AFLP CFLP EMD LDR, LCR, Padlock Invader RAPD, AP-PCR DT-PCR AS-PCR Химические методы химическое расщепление гетеродуплексов химическое лигирование По электрофоретической подвижности полиморфных фрагментов SSCP Гетеродуплексный анализ Детекция на твердой фазе гибридизация на олигонуклеотидных матрицах оптиковолоконный ДНК гибридизационный анализ элонгация иммобилизованных праймеров (минисеквенс) пиросиквенс Хроматографические методы CDGE, TGGE, DGGE, DHLPC Физические методы MALDI-TOF, TAQ-MAN Химия анализа Аналитические детекторы Высокопроизводительный анализ SNP +

ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP) – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов 1)ПЦР-аплификация 2)Рестрикция 3)Электрофорез

NFQ MGB R NFQ MGB R : Репортер : Нефлюоресцентный гаситель : Minor Groove Binder (T m Enhancer) Структура TaqMan ® MGB зонда MGB увеличивает температуру плавления (T m ) зонда. Возможно применение более коротких зондов. Лучше дискриминация точечных замен

SNP анализ GCGC ACAC NFQ FAM VIC GTGT ATAT FAM VIC NFQ Аллель 1 – генерируется сигнал от зонда с красителем VIC Используются мультиспектральные зонды Аллель 2 – генерируется сигнал от зонда с красителем FAM

Хроматографическая дискриминация точечных мутаций DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography)

Хроматографическая дискриминация точечных мутаций DHPLC - (denaturating high-performance liquid chromatography)

Клевазный тест- Third Wave Tech. - Invader assay Invader Oligo - Mut Probe T m span C bases

Pyrosequencing light time

Affymetrix Inc.

Предлагаемый нами аналитический подход Химия анализа: Реакция минисеквенирования на матрице ПЦР-амплифицированной ДНК Легко стандартизируется, не критична к температурным режимам гибридизации Аналитическая часть: Масс-спектрометрический анализ продуктов реакции Не требуется использование изотопных или флуоресцентных меток, высокая точность и скорость анализа

Реакция минисеквенирования A G T A G PCR ssDNA Отжиг олигонуклеотидного зонда + ddT, +ddC, +ДНК полимераза С или Детекция

Масс-спектрометрический этап Ионизация Регистрация масс-спектра Сортировка заряд/масса Принцип : Измерение отношения массы заряженных частиц к их заряду Требования: Разделение достроенных олигонуклеотидных зондов, отличающихся по 3-окончанию. Аналитический диапазон : 4000 – 8000 Da. Необходимая точность: +/- 9 Da (разница между ddT и ddC)

MALDI-TOF Ионизация -MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption\Ionization) лазерная десорбция и ионизация в присутствии вспомогательного вещества – матрицы МАТРИЦА: * Поглощает энергию лазерного излучения, вскипая увлекает в газовую фазу молекулы анализируемого вещества * Способствует ионизации Регистрация -TOF (Time of Flight) Измерение времени (time of flight) требующегося ионам для достижения детектора (пропорционально квадратному корню соотношения заряд/масса)

Масс-спектрометрический этап Проблемы : Деградация нуклеиновых кислот входе ионизации Многозарядность Образование комплексов с другими заряженными молекулами Решения: Применение MALDI-TOF схемы масс-спектрометрии Хроматографическая очистка аналита на ионнообменной смоле

разрешениеразрешение Разрешение и точность MALDI-TOF-MS

Reflex IV (Bruker Daltonics) Масс-спектрометрический этап

Аналитическая мишень: AnchorChip 400TF-384 (Bruker Daltonics) Стальной тефлонизиро- ванный планшет на 384 образца Матрица: 3-гидроксипиколиновая кислота Масс-спектрометрический этап

Снятие спектра в автоматическом режиме 30 импульсов / 10 секунд / 1 образец

Интерпретация: = 330 Da (dG) = 298 Da (ddA) +dG+ddAисх.

Принципиальная аналитическая схема

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы ПроблемыРешения Очистка ампликонов перед реакцией минисеквенирования SAP-дефосфорилирование dNTP Оптимизация реакции минисеквенирования Использование рекомбинантной ДНК полимеразы, эффективно включающей ddNTP Очистка образцов перед MALDI- TOF спектрометрией 1) Реакционные буферы без K, Tris H-Cl 2) Ионнообменная хроматография Повышение чувствительности системы 1) Масс-тюнинг олигонуклеотидов 2) Использование AnchorChip планшетов

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Амплификация, дефосфорилирование, минисеквенирование в микропланшетном формате (96 или 384 образцов)

Разработка высокопроизводительной аналитической схемы Автоматизированное нанесение образца на мишень при помощи Biomek 2000 Wor- kstation (Beckman Coulter) Объем образца – 200 nl.

Дальнейшие перспективы: Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998)

Мультиплексорность (Ross et al. Nature Biotechnology 1998)

Зарубежные аналоги и другие высокопроизводительные системы генотипирования Название/ Производител ь Метод (Химия/Детекция) Производ и- тельность SNP/день MassArray 200 K System (Sequenom) Минисиквенс/MALDI-TOF Genolink (Bruker Daltonics) Минисиквенс/MALDI-TOF1440 Pyrosequencing (Biotage AB) Минисиквенс/люминисцентная детекция TaqMan Assay (Applied Biosystems) Дискриминирующая гибридизация /флуоресцентная детекция 9000

Значимость анализа SNP. Исследовательский аспект Идеальные маркеры для геномного скрининга Среднее растояние между маркерами ~1000нт-5000нт Поиск кандидатных генов мультифакториальных заболеваний Удобные маркеры молекулярной эволюции

Значимость анализа SNP. Прикладное значение Генетическая паспортизация человека. Индивидуализированное определение уже известных SNP-профилей, ассоциированных с: предрасположенностью к развитию мультифакториальных заболеваний: Кардиоваскулярные патологии Нейродегенеративные заболевания Злокачественные новообразования индивидуальной чувствительностью к лекарственной терапии

Генотипирование Геном – совокупность всего генетического материала организма Генотип – совокупность данных о всех или избранных вариантах генетического материала. Точечный нуклеотидный полиморфизм Делеции, инсерции Хромосомные аберрации Генотипирование – комплекс лабораторных процедур, направленных на получение информации о генетическом статусе индивидуума.

Генотипирование Вопросы и ответы… Задачи и значимость генотипирования человека? Объект исследования? Методика? Интерпретация результата?

Генотипирование в медицине Информационная значимость Оценка индивидуальных рисков развития мультифакторных заболеваний Оценка индивидуальной предрасположенности/резистентности к инфекционным заболеваниям Определение индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам Информация, актуальная при планировании семьи Формат индивидуальной медицины Медицинский генетический паспорт

Важное замечание… Генотипирование – это скрининговая процедура, направленная на анализ наследуемых признаков. Процедуру генотипирования достаточно выполнить единственный раз, так как в ходе исследования определяются генетические комбинации единожды унаследованные от генетических родителей.

Объект исследования? SNP single nucleotide polymorphism точечный нуклеотидный полиморфизм а так же непротяженные инсерции и делеции в нуклеотидной последовательности

SNPs (single nucleotide polymorphisms) - однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1% (Brookes, A.J The essence of SNP. Gene 234: ) Пример: замена G на A в позиции 1691 гена V фактора свертывания крови (Ляйденовская мутация) Геном человека – предположительно до 10 млн SNP. Точечный нуклеотидный полиморфизм, а так же более крупные генетические повреждения (делеции, хромосомные аберрации) являются формальной причиной развития как моногенных, так и мультифакторных заболеваний Точечный нуклеотидный полиморфизм – элементарная аналитическая единица генетического исследования

Технологические и биоинформационные возможности современных медицинских лабораторий позволяют использовать эти знания в диагностических целях Информация о медицински значимых полиморфизмах – результат научно- исследовательских работ

Публикации в год по взаимосвязи генотип- фенотип

Актуальные направления медицинского генотипирования Категории/полиморфизмы Сердечно-сосудистые заболевания Онкологические заболевания Нейро-дегенеративные заболевания Заболевания обмена веществ Фармакогеномный анализ – 900 ПРИМЕРЫ…

Коагуляционный каскад

Транскрипционные факторы и их лиганды в регуляции обмена холестерина и жирных кислот PPA R Cholesterol Lanosterol Isoprenoids Acetyl CoA 7-Dehydro- Cholesterol Oxysterols ABCA1, G1, G5, G8 Insects Fatty Acids LX R CYP4A ABCB4, D2, D4 Diet 1,25-Dehydroxy- Vitamin D3 VDR CYP24 20-Hydroxy- Ecdysone EcR 26OHase E2 3 CYP7A1 Bile Acids FXR Retinoic Acids CYP26 Diet PX R CA R Xenobiotics Steroids RA R RX R CYP3A CYP2B ABCB1, C2, D3 CYP7A1 CYP8B1 ABCB11 CYP27B1 Plants

Полиморфизмы генов системы свертывания крови

Печальные примеры… Смерть двухкратного олимпийского чемпиона Сергея Гринькова. Возможные причины развития острого коронарного синдрома – повышенная адгезия тромбоцитов вследствие мутации C –1565-T (L33P) в гене фактора агрегации тромбоцитов GPIIIA Lancet Jun 29;347(9018):1833.Clues to the death of an Olympic champion. Goldschmidt- Clermont PJ, Shear WS, Schwartzberg J, Varga CF, Bray PF.

Полиморфизмы генов липидного обмена Полиморфизмы предрасположенности к развитию гипертензивных состояний

Генетические факторы предрасположенности к онкологическим заболеваниям Рак молочной железы и яичников Делеционные мутации в генах BRCA1 и BRCA2. Охарактеризовано более мутаций. Носители таких мутаций имеют на 80% увеличенный риск развития рака молочной железы и/или яичника в возрасте до 60 лет Показана необходимость определения полной нуклеотидной последовательности генов или наиболее распространенных мутаций

Предрасположенность к развитию колоректального рака Adapted from Burt RW et al. Prevention and Early Detection of CRC, 1996 Sporadic (65 %– 85%) Familial (10 %– 30%) Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) (5%) Familial adenomatous polyposis (FAP) (1%) Rare CRC syndromes (

Генетические маркеры развития рака молочной железы и яичников Полиморфизмы генов системы детоксикации организма

Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) Lazarou et all JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: 2,2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями от правильно назначенных препаратов Свыше случаев со смертельным исходом 4-6 место среди причин смерти

Значимость генотипирования в оценке эффективности проводимой терапии. Фармакогеномика – наука, изучающая влияние генетических факторов на особенности реакции организма в ответ на медикаментозное воздействие

Задачи фармакогеномики Разработка оптимальных мишеней для фармакологического воздействия 90% потенциальных лекарственных препаратов отсеиваются только на этапах клинических испытаний Разработка клинических фармакогеномных тестов

Неблагоприятные лекарственные реакции (Adverse Drug Reactions – ADR) Lazarou et all JAMA (Journal of the American Medical Association) В 1994 году в США зарегистрировано: 2,2 млн. случаев тяжелых осложнений, обусловленных неблагоприятными лекарственными реакциями Свыше случаев со смертельным исходом 4-6 место среди причин смерти

Лекарства с ярко выраженной индивидуальной переносимостью (по A.Philips, JAMA 14,2001) Therapeutic Category With Drug ClassDrug Cardiovascular B-blockersAtenolol, metoprolol Angiotensin-converting enzyme inhibitorsLisinporil DiureticsFurosemide, hydrochlorothiazide Calcium channel blockerDitiazem, verapamil Inotropic agents/pressorsDigoxin Analgetic Nonsteroidal anti-inflammatory drugsAspirin, piroxicam, ibuprofen, naproxen Psychiatric Tricyclic antidepressantsImpramine hydreochloride, notripthyline hydrochloride Antibiotics PenicillinAmoxicillin Antitubercular agentsIsoniazid, rifampicin MacrolidesErythromycin Other AnticoagulantsWarfarin sodium CorticosteroidsPrednisone AnticonvulsantsCarbamazepine, phenytoin Antidiabetic agentsInsulin BronchodilatorsTheophylline AntihistamineMeclizine hydrochloride

Основные причины неблагоприятных лекарственных реакций Ошибочное назначение препарата Качество лекарственного препарата Индивидуальная чувствительность Генетически детерминированная недостаточность или избыточность ферментов, метаболизирующих лекарственный препарат Нарушения в транспорте лекарственных препаратов и др. причины, не связанные с метаболизмом

Этапы метаболизма лекарственных препаратов Фаза I Фаза II Фаза III Цитохромы P450 Эпоксид-гидролазы Глютатион-трансферазы N-ацетил трансферазы Активация ксено- биотиков с образова- нием активных про- межуточных электро- фильных метаболитов Преобразование активных промежуточных метаболитов в водорастворимые нетоксичные компоненты Выведение водорастворимых нетоксичных компонентов из организма

Генетический полиморфизм ферментов детоксикации экспозиция активация детоксикация высокая низкая Фаза I Фаза II высокая низкая высокая низкая высокая низкая высокая низкая высокая Риск развития патологии

Цитохромы человека 15 групп подгруппа: 001A 001B 002A 002B 002C 002D 002E 002F 002G 002J 003A 004A 004B 004F 005A 007A 007B 008A 008B 011A 011B 017A 019A 021A 021B 024A 026B 027A 027B 051A 051P 59 генов 001A01 001B01 002A06 002A06V2 002A07 002A07P 002A13 002B06 002B07P 002C00 002C08 002C09 002C10 002C17 002C18 002C19 002D06 002D07P 002D08P 002E01 002F01 002G01 002J02 003A03 003A04 003A05 003A05P 003A07 003A43 004A11 004B01 004F02 004F03 004F03v1 004F08 004F09P 004F10P 004F11 004F12 005A01 007A01 007B01 008A00 008B01 011A01 011B01 011B02 017A01 019A00 021A01 021A02P 021B00 024A00 026B01 027A00 027B01 051A00 051P01 051P02

Функциональная значимость Метаболизм широкого спектра эндогенных (холестерин, стероидные гормоны, простагландины) и экзогенных (лекарственные препараты, канцерогены, мутагены, аллергены, пестициды) субстратов. Развитие мультифакториальных заболеваний в следствие нарушения экспрессии и регуляции генов индифидуальных цитохромов

Полиморфизм генов цитохромов, ассоциированных с нарушенным метаболизмом ряда лекарств (по A.Philips, JAMA 14,2001)

Ассоциация лекарственных препаратов, часто вызывающих побочные реакции и полиморфизма генов детоксикации (по A.Philips, JAMA 14,2001)

CYP2C9. Биологическая значимость Подгруппа CYP2C 18% от всей цитохромной фракции печени Катализирует ~20% CYP-зависимых лекарственных препаратов СYP2C9 – варфарин, фенитоин, лозартан, ирбесартан, толбутамид, глипизид, торсемид, ибупрофен, пироксикам, изониазид.

Варфарин Антикоагулянт непрямого действия Производное 4-гидроксикумарина Ингибирует синтез витамин-К зависимых факторов свертывания крови (факторы: VII, IX, X, II)

Варфарин: Показания Профилактика и/или лечение: Венозные тромбозы Легочная эмболия Тромбоэмболические осложнения, связанные с мерцательной аритмией и трансплантацией сердечных клапанов Инфаркт миокарда: снижение риска смерти, повторного инфаркта миокарда и случаев тромбоэмболических осложнений (инсульт, системная эмболия) Профилактика и лечение кардиогенной эмболии

Побочный эффект - кровотечение Факторы риска: Сопутствующие заболевания Применение других препаратов Нарушения дозировки Интенсивное воздействие антикоагулянта Индивидуальная чувствительность (обусловлена генетическим полиморфизмом в основном метаболизируещем ферменте – CYP2C9)

Полиморфизм гена CYP2C9 Аллельные варианты гена: CYP2C9*1 – нормальная каталитическая активность CYP2C9*2 (Arg144Cys) - пониженная каталитическая активность CYP2C9*3 (Ile359Leu) – выраженная пониженная каталитическая активность Exon 3 Exon 7 CGTATT ArgIle Exon 3 Exon 7 TGTATT Arg Cys Ile Exon 3 Exon 7 CGTCTT Arg Leu

Возможности генетической идентификации мутантных аллелей CYP2C9 Ggagcattgaggaccgtgttcaagaggaagcccgc ggagcattgaggatcgtgttcaagaggaagcccgc Aggtccagagatgcattgaccttctccccaccagcc aggtccagaggtaccttgaccttctccccaccagcc AvaII NsiI KpnI *2 *1 *3

Полиморфизм гена CYP2C9 в российской поппуляции Клиническая группа: мужчины старше 35 лет (n=186) CYP2C9 *1/*1126(67,7%) CYP2C9 *2/*130(16,1%) CYP2C9 *2/*24(2,1%) CYP2C9 *3/*124(12,9%) CYP2C9 *3/*30(0%) CYP2C9 *2/*32(1,1 %) Частота встречаемости аллелей: CYP2C9*10,82 CYP2C9*20,11 CYP2C9*30,07

Полиморфизм гена CYP2C9 и терапевтическая доза (мг/сутки). C.R.Lee et all Pharmacogenetics. Выборк а Генотип *1* 1 *1* 2 *1* 3 *2* 2 *2*3*3* ,593, ,5

Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Фенитоин. Эпилепсия, постравматические состояния, нарушения мышления, болевые синдромы Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей. Симптомы передозировки: атаксия, сонливость, дефицит витамина D и фолиевой кислоты

Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Толбутамид Инсулинонезависимый сахарный диабет легкого и среднетяжелого течения Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*3 аллелей.

Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Лозартан (блокада ангиотензиновых рецепторов) Артериальная гипертензия Метаболизируется в фармакологически активную форму ферментом CYP2C9 и частично CYP3A4 Показан пониженный метаболизм препарата у носителей CYP2C9*3 аллелей.

Полиморфизм гена CYP2C9 и метаболизм других CYP-зависимых лекарственных препаратов. Диклофенак, хлорпропамид, глипизид, флурбипрофен, торсемид, ирбесартан, ибупрофен Показаны CYP2C9-ассоциированные эффекты in vitro. Идут масштабные исследования in vivo

Интерпретация результатов генотипирования Плейотропность влияния генетических полиморфизмов Оценка действия факторов внешней среды Вклад индивидуальных факторов (курение, алкоголь, диета) Осуществляется разработка биоинформационной базы данных по медицински значимым генетическим полиморфизмам Достоверность Степень риска Этническая привязка

Кооперативный эффект генетических и средовых факторов, определяющих риск развития инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет

NГенПолиморфизмы Преобладающий генотип (Европейцы) Результат анализа 1 Ангиотензин- конвертирующий фермент АСЕAlu I/DID 2 Аполипротеин С3АРОС3 -482C/TСCСCCT T/CTTTC C/G (SstI)CC 5 Липопротеидная липазаLPL C>G Сер447СтопCC 6N291S A/GAA 7 Протромбин (Коагуляционный фактор II) F2F2G AGG 8 Фактор Ляйдена (коагуляционный фактор V) F5F5G-1691-AGG 9 Ингибитор активатора плазминогена SERPINE 1 (PAI-I) –675 (4G(-675)5G).5G/4G 10Фибриноген FGB beta polypeptid e G –455AGGGA 11 Тромбоцитарный рецептор фибриногена ITGB3 (GP IIIa) T –1565-C (L33P)TTTC 12 Метилентетрагидрофолатред уктаза MTHFRС-677-T (A223V)СCСCCT 13Коагуляционный фактор VIIF VII Arg353Gln G/A GG 14 Цитохром CYP2C9 (Чувствительность к варфарину) CYP2C9 R144C (CYP2C9*2) CYP2C9*1 15L208V (CYP2C9*3) Результат генетического анализа. Пациент #V26.

Результат генетического анализа. Пациент #V26 (продолжение). NГенМутация Преобладающий генотип Результат анализа 1ADH1B 3 exonR-47-H G/A GG 2ALDH2 12 exon E-487-K G/A GG 3CYP2E1 5-region-1293 to G/CGG 4CYP2E17 intron9896 C>GCC NГен Полиморфизм Результат анализа 1Breast cancer gene 1BRCA1185 delAGне обн. 2Breast cancer gene 1BRCA1T181Gне обн. 3Breast cancer gene 1BRCA14153delAне обн. 4Breast cancer gene 1BRCA15382insCне обн. 5Breast cancer gene 2BRCA21528delAAAAне обн. 6Breast cancer gene 2BRCA21099SX C>Gне обн. 7Breast cancer gene 2BRCA26174delTне обн. 8Breast cancer gene 2BRCA29318delAAAAне обн. 9 CYP1A1 I462V A1506GAG 10 CYP2D6 G-A nt1 GG 11 glutathione S-transferaseGSTP1I105V G/A GA 12 glutathione S-transferaseGSTP1A114V T/C CC 13 glutathione S-transferaseGSTT1del не обн. 14 glutathione S-transferaseGSTM1del не обн.

Медицинское генотипирование человека. Значимость: Предиктивность, индивидуальность, информативность. Оценка здоровья «здоровых» Оценка факторов риска при планировании семьи Учет индивидуальных особенностей лекарственной терапии Возможность построения принципиально новых диагностических алгоритмов

Перспективы…