Клеточные технологии в терапии ишемических поражений ЦНС Член-корреспондент РАМН К.Н.Ярыгин Член-корреспондент РАМН В.И.Скворцова ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова МЗ России ФГБУ «ИБМХ» РАМН; ФГБУ «НИИОПП» РАМН

Болезни и повреждения центральной нервной системы занимают значительное место в структуре заболеваемости, инвалидизации и смертности. Инсульт головного мозга, болезнь Альцгеймера и другие возрастные деменции находятся среди основных причин инвалидности людей пожилого возраста, травмы головного и спинного мозга, латеральный амиотрофический склероз, рассеянный склероз – молодых и зрелых людей, а детский церебральный паралич – детей. Исследования последних лет с использованием моделей человеческих патологий на животных показали, что методы регенеративной медицины и, в частности, клеточная терапия, эффективны в большинстве случаев независимо от конкретного заболевания.

Накопленные к настоящему времени в лабораториях и клиниках данные показывают, что трансплантация содержащих стволовые клетки (СК) препаратов способна снижать выраженность функциональных нарушений, развивающихся при острой и хронической ишемии головного мозга. На экспериментальных моделях были протестированы многие типы СК и их производных на разных стадиях дифференцировки, трансплантируемые в широком диапазоне доз различными способами однократно или повторно, причем во всех случаях регистрировали сходные эффекты. Изучение клеточных и молекулярных механизмов трансплантации СК, особенно при использовании не-нейральных СК, привело к постепенной смене парадигмы с заместительной на организующе-стимулирующую (В.Н.Ярыгин). В эксперименте было показано, что трансплантация СК и производных ограничивает воспаление, противодействует гибели нейронов и стимулирует восстановительные процессы с участием собственных СК реципиента. Первые клинические исследования показывают, что клеточная терапия может значительно улучшить структуру исходов при ишемических поражениях мозга и стать одним из важных методов терапии инсульта.

Клинические исследования по трансплантации СК при заболеваниях и повреждениях ЦНС 1.Компания Athersys проводит клинические испытания фазы 2 с участием 140 пациентов с ишемическим инсультом, которым через 1-2 дня после инсульта вводили продукт MultiStem на основе аллогенных МСК 2.Cytomedix (Aldagen) проводит исследование по введению ~100 пациентам аутологичных МСК через ~ 3 weeks после ишемического инсульта 3.Georgia Health Sciences University: клиническое исследование фазы 1/2 (40 пациентов) по трансплантации СК пуповинной крови грудничкам и детям с детским церебральным параличом 4.The University of Texas Health Sciences Center in Houstons: введение аутологичных мононуклеаров, выделенных из костного мозга, пациентам с травмой головного мозга 5.ReNeuron: клиническое исследование фазы 1 по введению генетически модифицированных аллогенных НСК, полученных из мозга эмбрионов, для лечения последствий инсульта (трансплантация через 6 месяцев – 5 лет после инсульта); на этой неделе опубликованы результаты после 2-летнего периода – положительные в плане эффективности 6.Stem Cells, Inc.: исследование фазы ½ по трансплантации НСК, выделенных из donated brain tissue пациентам со спинальной травмой, возрастной макулярной дегенерацией и детям с болезнью Pelizaeus-Merzbacher 7.Mayo Clinic: клиническое исследование фазы 1 по трансплантации аутологичных МСК пациентам с латеральным амиотрофическим склерозом

При острых и хронических поражениях ЦНС, независимо от типа поражения целесообразно Ограничивать объем повреждения ткани мозга противодействуя потере функционально полноценной ткани в результате воспаления и образования рубца. Активировать неоангиогенез, особенно при выраженной ишемии. Стимулировать иммунитет, одновременно ограничивая аутоиммунные реакции. Стимулировать продукцию нейротрофических факторов. Рекрутировать собственные стволовые и прогениторные клетки в зону повреждения. Замещать потерянную ткань или клетки. Все эти эффекты наблюдаются при экспериментальной ишемии мозга после трансплантации МСК или НСК внутривенно или непосредственно в ткань мозга.

Свойства МСК Неиммуногенность, что позволяет использовать для трансплантации аллогенные клетки Способность к инвазии тканей Тропность к очагам ишемии, воспаления, механических и других повреждений

Цель исследования комплексное изучение действия мезенхимальных стволовых клеток (МСК) на моделях ишемического инсульта у крыс

Эндоваскулярная модель инсульта метод окклюзии СМА с помощью нейлоновой нити с силиконовым наконечником Достоинства данного метода: существенно меньшая хирургическая инвазивность хорошая воспроизводимость большого очага поражения контроль реперфузии (LDF)

Клеточная терапия инсульта Эксперименты выполнены на белых крысах-самцах линии Вистар, с исходной массой г; В качестве экспериментальной модели использовали: - модель с электрокоагуляцией дистального отдела СМА; - эндоваскулярную модель инсульта с реперфузией Опытной группе вводились МСК из плаценты, меченные магнитными микросферами ME02F с флуоресцентной меткой, диаметром 0,96 мкм, Bangs Laboratories на 2 сутки после операции в концентрации 2 млн/1мл физ.р-ра внутривенно; Контрольную группу составили крысы с аналогичным инсультом, но без введения клеток.

Методы оценки неврологического дефицита Шкала оценки неврологического дефицита по модифицированной шкале ( Шкала оценки неврологического дефицита по модифицированной шкале ( Chen, J. et al. Stroke 2001) Тест «открытое поле» Тест «открытое поле» Тест «крестообразный лабиринт» Тест «крестообразный лабиринт»

Шкала оценки неврологического дефицита по модифицированной шкале mNSS ( (Chen, J. et al. Stroke 2001)Показатели: Спонтанная активность Спонтанная активность Тест на моторику : симметричность движения конечностей животного при подвешивании за хвост; при помещении на горизонтальную поверхность; способность взбираться по проволочной сетке. Тест на моторику : симметричность движения конечностей животного при подвешивании за хвост; при помещении на горизонтальную поверхность; способность взбираться по проволочной сетке. Проприоцептивная чувствительность Проприоцептивная чувствительность Оценка рефлекторной реакции животного: реакция животного на прикосновение к усам; роговичный рефлекс, страртл-рефлекс Оценка рефлекторной реакции животного: реакция животного на прикосновение к усам; роговичный рефлекс, страртл-рефлекс 18 баллов - норма 18 баллов - норма поражение легкой степени поражение легкой степени поражение средней тяжести поражение средней тяжести 1-6 – поражение тяжелой степени 1-6 – поражение тяжелой степени

Тест «Открытое поле» Показатели Пробег Пробег Количество стоек Количество стоек Интенсивность груминга Интенсивность груминга Число переходов I (пересечение внешней окружности) Число переходов I (пересечение внешней окружности) Число переходов II (пересечение внутренней окружности) Число переходов II (пересечение внутренней окружности) Количество болюсов Количество болюсов

Тест «Крестообразный лабиринт» Показатели Время на свету Время на свету Количество стоек Количество стоек Выглядывания из темного отсека Выглядывания из темного отсека Число переходов Число переходов

Оценка неврологического статуса – модифицированная шкала mNSS (modified Neurological Severity Score, J.Chen с соавт., 2001) Поведенческие тесты для оценки интегративной деятельности мозга Тест «Открытое поле» Тест «Крестообразный лабиринт»

Метод: BRUKER BioSpec 7.0 T (Германия).

/ Группа контроля n=26 Группа с внутривенным введением СК n=9 Группа с интрацеребральным введением СК n=8 Общее кол-во животных с эндоваскулярной моделью окклюзии: n=43 Эндоваскулярная модель окклюзии СМА у крыс

3 дня после окклюзии средней мозговой артерии

1 2 3 Побочные патологические реакции со стороны мозга и мягких тканей головы 1. Отек и гематома мягких тканей головы 2. Церебрит 3. Воспалительные реакции оболочек мозга

3 SNAP 7 SNAP Накопление стволовых клеток, меченных оксидом железа, вокруг зоны поражения на 7-й день после операции (МРТ режимы Т2-WI и DWI) 3 DW DW-500

Накопление стволовых клеток, меченных микрочастицами оксида железа в декстрановой оболочке, в зоне ишемического поражения Окклюзия СМА методом электрокоагуляции с последующим введением СК в дозе 2 х10 6 на 2 -е сутки после развития инфаркта мозга Л.В.Губский, А.Учеваткин 2008 Bio Spec 70/30 (Bruker, Germany) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 Тл/м

14 SNAP 14 DW 14 T2 Визуализация миграции стереотаксически введенных меченных мезенхимальных стволовых клеток у крыс с электрокоагуляцией средней мозговой артерии

Визуализация миграции внутривенно введенных меченных мезенхимальных стволовых клеток у крыс с интралюминальной окклюзией средней мозговой артерии МРТ изображения одного среза головного мозга крысы А3 на SNAP-режиме: а) на следующий день после операции; б) через 5 дней после операции; в) через 10 дней после операции. Желтой стрелкой показана область снижения сигнала подозрительная на присутствие меченных стволовых клеток. Зона инфаркта показана черной стрелкой. А Б В

Накопление меченых парамагнетиком МСК вокруг зоны ишемического поражения через 2 недели после трансплантации

Накопление меченых парамагнетиком МСК в гиппокампе через 2 недели после трансплантации; А – контроль; В – трансплантация МСК: желтой стрелкой показана зона сниженной эхогенности на стороне инсульта, свидетельствующая о присутствии парамагнетика; красной стрелкой показана зона сниженной эхогенности в контралатеральном полушарии.

Влияние в/в введения СК на неврологические изменения и физиологическое поведение крыс с ишемическим инсультом (окклюзия СМА) Положительная динамика при выполнении поведенческих тестов попо Тест «Открытое поле» (оценка двигательной активности животных) до 7 14 до 7 14 Сутки P=0.004 P=0.01 P=0.04 Достоверное улучшение (р=0,034) неврологического статуса животные с ОСМА+МСК по сравнению с животными с ОСМА-МСК *

P=0.04 P=0.01

P=0.04 P=0.03 P=0.004

Динамика объема очага ишемического поражения мозга при введении стволовых клеток

Объем очага ишемии у контрольных крыс (верхние панели) и у животных, которым трансплантировали МСК (нижние панели) в день трансплантации (а) и через 7 дней (b), 14 дней (c) и 21 день (d).

Сокращение объема зоны ишемического повреждения ткани мозга крысы после в/в трансплантации МСК плаценты человека Режим МРТ Объем зоны повреждения, мм 3 1 день7 дней14 дней30 дней T2-WI (RARE) контроль 190,1±33123,8±1975±1164±12 T2-WI (RARE) МСК 172±36112±2438±723±3

Экспериментальных животных декапитировали на разных сроках Производили фронтальные серийные последовательные срезы головного мозга крыс толщиной 10 мкм

Трансплантированные клетки в большом количестве сосредоточены вокруг сосудов через 7 дней после ишемии Зеленое свечение – магнитные микрочастицы. Синее – ядра, окрашенные DAPI

На 14 е сутки отчётливо наблюдается трек миграции, что подтверждают данные, полученные методом МРТ. Трек миграции МСК, меченых микрочастицами (зелёное свечение)

ABC D Distribution of Dil-Labeled pMSC in the Brain of Rats after MCAO A – ischemia zone, 1 week after MCAO (x400); B - ischemia zone, 2 weeks after MCAO (x400); C - hippocampus, 3 weeks after MCAO (x400); D – hippocampus, 3 weeks after sham operation (X400).

Distribution of pMSC Labeled with Magnetic/Dragon Green Microparticles in the Brain of Rats after MCAO A – ischemia zone, 2 weeks after MCAO (x 400); B - hippocampus, 3 weeks after MCAO (x400). AB

Субвентрикулярная зона Стриатум. Треки миграции Зона ишемии: стриатум Индуцированный инсультом нейрогенез в ипсилатеральных СВЗ и стриатуме крысы. Окраска антителами против Ki67 через 3 недели после ОСМА.

Индуцированный инсультом нейрогенез в СВЗ и стриатуме крысы. 2 недели после ОСМА. Окраска АТ против даблкортина. Из публикации: Kernie & Parent Neurobiol. Dis. (2010), 37 (2),

Индуцированное инсультом подавление миграции нейробластов из СВЗ в гранулярный слой ипсилатеральной обонятельной луковицы. 4 недели после ОСМА. Окраска АТ против BrdU. Из публикации: Kernie & Parent Neurobiol. Dis. (2010), 37 (2),

Животное с инсультом плюс МСК. Окрашивание антителами к Ki недели после ОСМА. Субвентрикулярная зона Субвентрикулярная зона и формирование треков

Индуцированный инсультом и трансплантацией чпМСК нейрогенез в ипсилатеральных СВЗ и стриатуме крысы. 3 недели после ОСМА и трансплантации. Окраска антителами против Ki67. ТрекиПериинфарктная зона

Нейрогенные зоны в головном мозге человека РМТ СВЗ СГЗ

Нейрогенные зоны в мозге мыши Zhao et al.: Cell, 2008, 132,

НСК НБ Ликвор Сосуд НСК –нейральная стволовая клетка; НБ – нейробласт; ОДБ – олигодендробласт; ЭК – эпендимальная клетка НСК, отвечая на сигналы, приходящие из ликвора, крови или окружающих клеток, асимметрично делится с образованием одной клетки, тождественной материнской и второй, дифференцирующейся в нейрон или олигодендроцит; НБ двигаются к месту назначения сначала вдоль отростков НСК, а потом вдоль отростков радиальной глии и сосудов; ОДБ перемещаются вдоль отростков существующих нервных клеток. Скорость пролиферации НСК контролируется большим количеством эндогенных факторов, в том числе уровнем глюкокортикоидов, BDNF, NGF, VEGF, IGF-1, серотонина, глутамата, про-воспалительных цитокинов и др. На скорость пролиферации НСК и эффективность их участия в гомеостатической, адоптивной или репаративной регенерации ткани мозга влияет образ жизни. Например, интеллектуальная и двигательная активность стимулируют, а отсутствие таковых ингибируют нейрогенез. ОДБ ЭК

НСК НБ Ликвор Сосуд ОДБ ЭК НЕЙРОГЕНЕЗ В ГИППОКАМПЕ НЕЙРОГЕНЕЗ = ПРОЛИФЕРАЦИЯ - АПОПТОЗ Известные активаторы нейрогенеза : Физическая и интеллектуальная активность, цитокины и факторы роста, эритропоэтин, трансплантация стволовых клеток, лекарственные препараты – статины, виагра, антагонисты глюкокортикоидных рецепторов, димебон Взаимодействие с клетками и матриксом «стволовой ниши» НЕЙРАЛЬНАЯ СТВОЛОВАЯ КЛЕТКА Факторы, присутствующие в крови и ликворе: глюкокортикоиды, про- воспалительные цитокины, BDNF, NGF, VEGF, IGF-1, серотонин, глутамат Химокины из очага ишемии, воспаления, травмы (SDF-1 и др.)