Микро-РНК мозга при острых нарушениях мозгового кровообращения и черепно-мозговой травме у детей Научный центр здоровья детей РАМН НИИ детской неотложной. - презентация

1 Микро-РНК мозга при острых нарушениях мозгового кровообращения и черепно-мозговой травме у детей Научный центр здоровья детей РАМН НИИ детской неотложной хирургии и травматологии ДЗ г. Москвы Союз педиатров России Пинелис В.Г., Кузенкова Л.М., Рошаль Л.М г. Москва

2 Клеточные и биохимические изменения Черепно-мозговая травма (ЧМТ) Нарушения мозгового кровообращения (инсульт). Cниженное обеспечение мозга кислородом и глюкозой ведет к аноксической деполяризации, во время которой происходит повышение внеклеточного К +, Na + и [Ca 2+ ] Увеличение концентрации глутамата в синаптической щели в десятки раз Yamamoto: Acta Neurochir S75: 31-34

3 Глутамат – двуликий Янус : нейромедиатор - нейротоксин Стойкое повышение [Na + ] i Развитие отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) Развитие второй фазы ОКД сопряжено с вторичным падением [NADH] до критического уровня и увеличением [FADН].

4 Использование флуоресцентных белков, экспрессирующих АТФ в отдельном нейроне, позволило обнаружить значительное снижение АТФ при действии глутамата

5 МикроРНК МикроРНК – молекула из семейства малых некодирующих РНК, контролирующая большинство функций клеток в норме и патологии. Размер – нуклеотидов 2000 микроРНК у человека 1.МикроРНК являются незаменимыми образованиями для клеток, т.к. они являются регуляторами многих биологических процессов, таких как, например, развитие и клеточная дифферециация. Животные, у которых не образуются микроРНК, или погибают, или не дают потомства (Klosterman WP and Plasterk RH, 2006). 2.Идентифицированы органные и клеточно-специфические микроРНК. 3. МикроРНК широко распространены в организме эукариот и у некоторых вирусов. Они регулируют экспрессию более 30% генов, кодирующих информацию о структуре белков, что делает их одними из наиболее важных генных регуляторов. 5. Роль микроРНК заключается не только в определении судьбы клеток и тканей, но и в дифференциации и поддержании тканевой специфичности. Так, мозг-специфическая микроРНК miR-134 контролирует образование шипиков в процессах. MiR-132, присутствуя в больших количествах в нейронах мозга, регулирует рост нейритов, ингибирование ее уменьшает этот показатель; mir-223 отвечает за работу глутаматного рецептора.

6 Биогенез и механизм действия микроРНК * Старокадомский П. Общий механизм процессинга микроРНК и реализации её активности., URL: (дата обращения: ). 6

7 1993 Описана первая микроРНК, Lin Показано явление РНК- интерференции у C. elegans 2001 Появление термина микроРНК (Science) 2006 Нобелевская премия за открытие РНК- интерференции (Fire A. и Mello) Хронология исследований микроРНК Всего публикаций по тематике микро РНК Из них 796 статей об исследованиях микроРНК в нейронах в норме и патологиии

8 Материалы и подходы для исследования мкРНК Материал для исследования: биоптаты ишемизированных участков мозга экспериментальных животных; образцы первичных клеточных культур нейронов; плазма крови. Материал для исследования: биоптаты ишемизированных участков мозга экспериментальных животных; образцы первичных клеточных культур нейронов; плазма крови. Технология MicroRNA microarray platform для детекции экспрессии мкРНК. Технология количественной ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа профиля экспрессии мкРНК и генов-мишеней Технология глубокого секвенирования мкРНК Подходы: Технология трансфекции для функционального анализа мкРНК

9 Повреждение мозгаmiRNA: upregulated miRNA: downregulated Функциональная значимость: сигнальные пути регуляции Ишемия/гипоксия miR-10a, mir-182 miR-200b, miR-298, miR-290, miR-145, miR-206, miR-497, miR-424, miR-223, miR-132, mir-155 miR-362-3p, miR-223, miR-210, miR-137, miR-27a, miR-218, Транскрипционная регуляция Апоптоз, воспаление Ионный гоместаз, клеточный цикл Нейропротекция, опухоли нейрогенез Черепно-мозговая травма miR-223, miR-451, miR-711, miR-292 miR-21, miR-107, miR-130a miR-433-3p, miR-541, Глуутаматная нейротоксичность, Клеточная дифференциация Глиоз Внутриклеточные сигнальные пути Профили экспрессии микроРНК при повреждении мозга Madathil S, et al. (2011) Повреждение мозга приводит к изменению профиля экспрссии микроРНК. Приведены данные только значимых микроРНК (высокая степень валидизации), определенных с помощью количественной ПЦР в реальном времени или трансфекции с последующим иммуноблотингом

10 Иерархическое двумерное кластерирование данных экспрессии микроРНК в ткани мозга и крови крыс при ишемии,вызванной транзиторной окклюзией средней мозговой артерии. Jeyaseelan K., et al, 2013 Анализ профилей экспрессии микроРНК через 24 и 48 час после ишемии выявил специфичные для ткани мозга и крови микроРНК с измененным уровнем экспрессии, среди которых 10 являются общими для всех исследованных образцов

11 Фокальная ишемия мозга, вызываемая фотохимически индуцируемым тромбозом мозговых сосудов сенсомоторной области коры. МРТ мозга крысы через 24ч после операции Ишемия сенсоромоторной области коры мозга

12 Материалы и подходы для исследования мкРНК Материал для исследования: биоптаты ишемизированных участков мозга экспериментальных животных; образцы первичных клеточных культур нейронов; плазма крови. Материал для исследования: биоптаты ишемизированных участков мозга экспериментальных животных; образцы первичных клеточных культур нейронов; плазма крови. Технология MicroRNA microarray platform для детекции экспрессии мкРНК. Технология количественной ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа профиля экспрессии мкРНК и генов-мишеней Технология глубокого секвенирования мкРНК Подходы: Технология трансфекции для функционального анализа мкРНК

13 Красный цвет соответствует увеличенной экспрессии мкРНК, синий - соответствует сниженной экспрессии. Овалами показаны выделяющиеся кластеры образцов ткани мозга крыс. Двумерное кластерирование данных уровня экспрессии микроРНК в мозге крыс через 24 и 48 часов после фототромбоза мозговых сосудов сенсомоторной области коры.

14 Усредненный уровень экспрессии микроРНК для двух кластеров образцов коры мозга крыс через 24 часа после фототромбоза мозговых сосудов сенсомоторной области коры.

15 Красный цвет соответствует гиперэкспрессии мРНК, синий - соответствует гипоэкспрессии мРНК Двумерное кластерирование данных уровня экспрессии мРНК в мозге крыс через 24 и 48 часов после одностороннего фототромбоза мозговых сосудов сенсомоторной области коры.

16 Гистограмма усредненного уровня экспрессии генов-мишеней исследованных микроРНК в коре мозга крыс через 24 и 48 часов после фототромбоза мозговых сосудов сенсомоторной области коры. ось Х - логарифм нормированного профиля экспрессии по основанию 2. гиперэкспрессия - больше 1 (красный цвет), гипоэкспрессия - меньше одного (синий цвет). Указанны значения - медианы.

17 1. Выявлена дифференциальная экспрессия микроРНК и регулируемых ими генов-мишеней в ткани мозга при фокальной ишемии сенсомоторной зоны коры головного мозга крыс. 2. Гены-мишени с измененным уровнем экспрессии вовлечены в процессы клеточной гибели, воспаления и нейрогенеза, характерные для ишемического повреждения ткани мозга. 3. Планируется разработка диагностической панели для получения профилей экспрессии микроРНК в плазме крови у детей с нарушениями мозгового кровообращения и ЧМТ. 4. Планируется исследовать влияние нейропротекторов на профили экспрессии микроРНК и генов-мишеней на клеточных и животных моделях ишемии/гипоксии...

18 Участники исследования Научный центр здоровья детей РАМН Пинелис В.Г., Сурин А.М., Бобров М.Ю.,. Гусар В.А.,Тимофеева А.В., Жанин И.С. НИИ неотложной детской хирургии и травматологии ДЗ г. Москвы Рошаль Л.М., Семенова Ж.Б. НИИ молекулярной генетики РАН акад. Мясоедов Н.Ф., Шрамм С.И.

19 Благодарю за внимание!

20 Биогенез микроРНК Предшественник микроРНК образуется из геномной ДНК, в результате чего появляется промежуточная форма при- микроРНК. В при-мкРНК образуется петля, которая подвергается двухстадийной обработке: вначале эндонуклеаза Drosha отрезает шпильку- пре- микроРНК. Она экспортируется в цитоплазму, где узнается ферментом Dicer. Он отрезает петлю от пре-мкРНК и получается структура зрелой мкРНК, которая включается в состав комплекса RISC. При полной комплементарности мкРНК происходит деградация мРНК, а при неполной ингибирование трансляции.

21 Профили экспрессии микроРНК и генов-мишеней (онтология) при экспериментальной ЧМТ Zhonghua Hu, et al., 2012 Результаты исследования указывают на то, что экспрессия многих микроРНК зависит от времени после возникновения ЧМТ и имеет место кооперативная регуляция внутриклеточных сигнальных путей, степень которой зависит от тяжести повреждения мозга

22 Профиль экспрессии мРНК в коре мозга крыс через 24 часа после фототромбоза мозговых сосудов

23 МикроРНК – это эндогенные, короткие до 22 нуклеотидов РНК, которые регулируют экспрессию генов на транскрипционном и трансляционном уровнях. Они составляют большое семейство генных регуляторов, контролирующие практически все функции клеток в норме и патологии. Функции микроРНК 1. МикроРНК являются незаменимыми образованиями для клеток, т.к. они являются регуляторами многих биологических процессов, таких как, например, развитие и клеточная дифферециация. Животные, у которых не образуются микроРНК, или погибают, или не дают потомства (Klosterman WP and Plasterk RH, 2006). 2. МикроРНК обязательно участвуют в возникновении определенного клеточного и тканевого фенотипов как в норме, так и в патологии (Jeyaseelan R., et al, 2007). 3. Идентифицированы органные и клеточно-специфические микроРНК. 4. МикроРНК широко распространены в организме эукариот и у некоторых вирусов. Они регулируют экспрессию более 30% генов, кодирующих информацию о структуре белков, что делает их одними из наиболее важных генных регуляторов. 5. Роль микроРНК заключается не только в определении судьбы клеток и тканей, но и в дифференциации и поддержании тканевой специфичности. Так, в мозгу мозг-специфическая микроРНК miR-134 контролирует образование шипиков в процессах. MiR-132, присутствуя в больших количествах в нейронах мозга, регулирует рост нейритов, ингибирование ее уменьшает этот показатель; mir-223 отвечает за работу глутаматного рецептора.

24 Bramlett H and Dietrich WD, 2004