Современные клинические и лабораторные тесты диагностики инфекционных и инвазионных болезней

План 1. Основные методы лабораторной диагностики 2. Иммунологические методы 3. Латекс - агглютинация 4. Иммунохроматографический анализ 5. Иммунофлюоресценция ( метод Кунса ). 6. масс - спектрометрия ( MALDI-TOF MS) 7. ПЦР - анализ 8. Заключение 9. Список использованной литературы

В арсенале специалистов в настоящее время есть разнообразные методы лабораторной диагностики, как классические, так и новейшие, появившиеся в последние десятилетия и нашедшие широкое применение в практике. Клиническая лабораторная диагностика является наиболее динамично развивающейся отраслью медицины, активно внедряющей и использующей современные научные достижения. Для оценки морфофункционального состояния отдельных органов и систем, диагностики многих болезней используют сотни различных лабораторно - клинических показателей ( тестов ). Глубина познания физиологических и патологических процессов, диагностическая значимость и надежность исследований зависят от правильности подбора лабораторно - клинических показателей. К основным методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний относятся иммунологические, микробиологические и молекулярно - генетические исследования, а также ряд новых методов.

В диагностике инфекционных болезней используют и многочисленные лабораторно-инструментальные методы, среди которых важнейшее место занимают специфические методы (бактериологический, вирусологический, иммунофлюоресцентный, паразитологический, серологический), имеющие целью установление этиологического (нозологического) диагноза. Материал для специфических методов исследования в зависимости от характера, формы и периода болезни может быть самым разнообразным: кровь, цереброспинальная жидкость, мокрота, фекалии, моча, дуоденальное содержимое, пунктаты и биоптаты органов, рвотные массы, отделяемое язв, смывы со слизистых оболочек, трупный материал.

Паразитологическое обследование основано на микроскопии толстой капли и мазков крови (при малярии), мазков крови и костного мозга (при лейшманиозе), мазков крови и пунктатов лимфатических узлов (при трипаносомозе, токсоплазмозе), кала (при амебиазе, балантидиазе), испражнений и дуоденального содержимого (при лямблиозе). Бактериологическое исследование включает посев материала, взятого у больного, на питательные среды, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию. Определение типовой принадлежности микроба-возбудителя имеет эпидемиологическое значение при выявлении источника инфекции. Вирусологическая диагностика по сравнению с бактериологической более сложна и трудоемка, что связано с особенностями биологии вирусов. Среди них наиболее важной является облигатный внутриклеточный паразитизм вирусов, что и накладывает отпечаток на методы их выделения с использованием тканевых культур или куриных эмбрионов

Иммунологические методы применяются для определения неизвестных АГ с помощью известных АТ, содержащихся в иммунных диагностических сыворотках ; а также для серологической диагностики – определения неизвестных АТ с помощью известного АГ – диагностикума. В настоящее время существует множество методик, в основе которых лежат указанные принципы. К наиболее известным и широко распространенным иммунологическим методам относятся : реакция агглютинации ( РА ), реакция непрямой ( пассивной ) агглютинации ( РНГА / РПГА ), реакция преципитации ( РП ), реакция иммуноэлектрофореза ( РИЭФ ), реакция связывания комплемрента ( РСК ), реакция иммунофлуоресценции ( РИФ ), иммуноферментный анализ ( ИФА ). Указанные методы давно применяются для диагностики инфекционных заболеваний и прочно вошли в медицинскую практику. В настоящее время на базе этих, уже ставших классическими, методов разработаны современные методики, такие как латекс - агглютинация, иммунохроматографические тесты, позволяющие быстро получать результаты. Достижением последнего десятилетия стало создание различных приборов, обеспечивающих автоматизацию процессов выполнения и анализа результатов исследований.

Латекс - агглютинация - агглютинация антителами частиц латекса, на поверхности которых адсорбирован антиген или гаптен ; Для постановки РАЛ применяют сенсибилизированные частицы полистирольного латекса, которые в присутствии гомологичного реагента склеиваются. Обычно эта реакция проходит очень быстро (3…8 мин ), что позволяет применить ее в качестве экспресс - метода для выявления антигенов и антител. Преимущества РАЛ в том, что частицы латекса в отличие от эритроцитов не имеют перекрестно реагирующих антигенов, поэтому она специфичнее РИГА.

Иммунохроматографический анализ это метод определения наличия определенных концентраций веществ в биологических материалах ( моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т. д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест - кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА сравнительно молодой метод анализа, он часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип - тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс - тест или экспресс анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения 1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемомуантигену или антителу, конъюгированные (" сшитые ") с коллоидным золотом красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест - полоски в физиологическую жидкость ( мочу, кровь ). 2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест - зоне полоски. 3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест - полоски. этого метода анализа. Рисунок 2, Иммунохроматографические экспресс - тесты Veda.Lab

Экспрессный метод диагностики инфекционных болезней с использованием иммунофлуоресценции (метод Кунса). Иммунофлюоресцентная диагностика, основанная на специфическом свечении комплекса антиген - антитело, позволяет получить ответ через несколько минут после обработки препарата из первичного материала специфической флюоресцирующей сывороткой. Рисунок 3. ИФА

масс - спектрометрия (MALDI-TOF MS ) - спектральный метод изучения целых бактериальных клеток и их основных компонентов, основанный на измерении массы молекул или атомов, позволяющий проводить как прямое белковое профилирование для видовой идентификации микроорганизмов, так и обнаружение генетических маркеров лекарственной устойчивости. Преимуществами данного метода является высокая скорость видовой идентификации микроорганизмов (2-5 мин.), возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования, высокая специфичность

Всё более востребованными становятся молекулярно - генетические методы, такие как полимеразная цепная реакция ( ПЦР ), «BROAD- RANGE» ПЦР и анализ эволюционно - консервативных генов, секвенирование / пиросеквенирование, фрагментация генома и анализ спектра фрагментов, гибридизация на микрочипах, геномная гибридизация, геномная амплификация и секвенирование и др Наряду с преимуществами, молекулярно - генетические методы обладают рядом недостатков, таких как отсутствие выделения культуры возбудителя, что не позволяет изучать свойства микроорганизмов ; невозможность выявления фенотипической устойчивости к антимикробным средствам ( возможно выявление только генетических маркеров устойчивости ); некоторые ограничения, связанные с наличием зарегистрированных тест - систем для выявления неполного спектра возбудителей инфекционных болезней.

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК - полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНКПреимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний. 1. Прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки - маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. 2. Высокая специфичность 3. Высокая чувствительность. 4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. 5. Высокая скорость получения результата анализа 6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Применение ПЦР - диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды ( вода, почва и т. д.). Рисунок 5. ПЦР - анализ

Заключение Таким образом, современная лабораторная диагностика инфекционных болезней обладает широким спектром разнообразных методов и способов исследований, сочетание которых позволяет оперативно решать поставленные задачи, доступных для использования в рутинной практике. Значение диагностики как процесса распознавания болезней состоит в том, что ранний, точный, исчерпывающий и максимально конкретный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исходов заболевания, а в инфекционной патологии служит еще и исходным моментом в проведении своевременных и направленных противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Список использованной литературы 1. Кондрахин И. П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики 2. Шувалова Е. П. Инфекционные болезни : Учебник е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, с.: ил. ( Учеб. лит. для студ. мед. ин - тов ). 3. Климов А. Ф., Акаевский А. И. « Анатомия домашних животных » Учебное пособие, Изд. « Лань », 2003 г 4. Васильев М., Воронин Е. « Практикум по клинической диагностике болезней животных », 2003 г. 5. Смирнов А. М., Беляев И. М., Дугин Г. А. « Практикум по диагностике внутренних незаразных болезней сельскохозяйственных животных », « Агропромиздат », 1985 г. 6. Смирнов А. М., Пушкарев Р. П. « Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней животных », « Агропромиздат », 1988 г.